白新伟，陈文辉

(六盘水师范学院化学与材料工程学院，贵州六盘水 553004)

脂肪胺是一类毒性较大且反应活性较高的有机胺类，广泛存在于自然界中。生物体内的蛋白质、氨基酸以及其他含氮类有机化合物都能够通过生物降解转化为脂肪胺。水产品在冷藏期间，也能在酶及微生物作用下从鱼类肌肉组织中分解成脂肪胺[1]。脂肪胺类化合物具有毒性以及潜在的致癌性[2 - 4]，因此,如何有效地检测冷冻海产品中脂肪胺已经成为一个重要研究课题。 目前对脂肪胺化合物分离分析最常用的方法是高效液相色谱法[5 - 7]，但色谱柱价格昂贵，有机溶剂消耗量大，分析时间长等缺点限制了该方法对脂肪胺化合物分离检测的应用。

毛细管电泳是[8 - 12]一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术,在脂肪胺类化合物的分离检测领域有着广泛的应用前景。但小分子脂肪胺大多无紫外吸收或紫外吸收较弱，所以一般采用毛细管电泳-间接紫外检测方法[8]，但存在灵敏度低和线性范围窄及背景吸收不稳定或基线漂移严重，难以保证峰形对称等诸多缺点。为克服以上方法存在的缺陷，采用柱前或柱后衍生化是一种行之有效的手段，所以寻找合适的脂肪胺衍生试剂一直是制约毛细管电泳法测定脂肪胺的关键和难点 。本实验以10-乙基吖啶酮-2-磺酰氯(EASC)作为柱前衍生试剂，获得的衍生物性质稳定，分离度效果好，检测灵敏度高。脂肪胺化合物标准品定性定量检测及实际冷冻鲅鱼样品的测定实验使毛细管电泳技术高效、快速等优势都得以充分的体现。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

HP-3D毛细管电泳仪(美国，Agilent公司)；熔融毛细管总长58.5 cm×50 μm i.d.，有效长度为50 cm。

脂肪胺标准品：甲胺、 二甲胺、乙胺、二乙胺、丙胺、丁胺、戊胺、己胺、庚胺、辛胺(昆明聚星达化学试剂有限公司公司)；衍生试剂：10-乙基吖啶酮-2-磺酰氯(EASC)(河北建新化工股份有限公司)；乙腈(色谱纯)(山东旭晨化工科技有限公司)。实验用水为超纯水。

1.2 标准品溶液的配制、衍生化及样品预处理

脂肪胺标准品溶液：准确称取脂肪胺标准品，用色谱纯乙腈配成1.0×10-5mol/L。衍生试剂EASC溶液(1.0×10-3mol/L)：准确称取8.1 mg EASC，溶于25 mL 无水乙腈。

标准品的衍生化:向安瓿瓶中加入20 μL脂肪胺混合标准溶液，80 μL EASC溶液，60 ℃水浴中反应3 min，稀释2倍后，进样10 μL分析。

实际样品预处理：参照文献方法[5]，冷冻鲅鱼融化后取可食用部分剁碎，准确称取 1.0 g 样品，加入3 mL 10% 三氯乙酸，冰浴条件下于乳钵中充分研磨匀浆并定容至 5 mL，然后以 1 500 r/min 离心 3 min。取上清液加冰乙酸中和后，即为待测样液，待用。

1.3 毛细管电泳条件

背景电解质为含15 mmol/L SDS的20 mmol/L硼酸盐缓冲液(pH为9.2)。采用压力进样的方式：50 mbar×8 s。分离电压18 kV，柱温25 ℃，检测波长为 219 nm。衍生后的标准溶液、样品溶液及背景电解质溶液进样前均用0.45 μm微孔滤膜过滤，再用超声波脱气10 min。每次进样前依次用0.1 mol/L NaOH溶液、超纯水和背景电解质溶液各冲洗毛细管2 min。

2 结果与讨论

2.1 衍生条件的优化

实验表明，10-乙基吖啶酮-2-磺酰氯对10种脂肪胺的衍生化产率随反应温度、衍生试剂用量不同而存在差异。衍生产率随反应温度升高，产率明显增大。当温度达到60 ℃时，衍生反应3 min后产物信号强度基本稳定，继续升高温度会引起衍生试剂轻度分解而影响衍生产率。衍生试剂的摩尔量为与样品摩尔比为4时衍生产物的信号强度最强。衍生产物在室温下保存，数周内色谱峰高皆无明显变化，说明衍生产物稳定性较好。

2.2 分离条件的优化

调整硼酸盐的浓度为10～30 mmol/L(pH 值为9.0)，对10 种脂肪胺衍生物混合标样进行分析。硼酸盐浓度低于15 mmol/L时，所有衍生物的信号峰较弱。硼酸盐浓度为20 mmol/L，分离效果好。继续增加硼酸盐浓度，分离效果无明显改善，以丁胺、戊胺、己胺、庚胺为例，如图1。所以确定硼酸盐浓度为20 mmol/L。

采用硼酸盐溶液(20 mmol/L)，调节其pH 值为9.0～9.4，分析混合标样。由图2可知随着pH[12]增加分析物之间分离度明显改善，直至为9.2。进一步提高pH值，分离效率呈下降趋势，选择缓冲溶液pH为 9.2。

图1 硼酸盐浓度对脂肪胺标准溶液分离的影响Fig.1 Influence of borate on separation of fatty amines

图2 pH对脂肪胺标准溶液分离的影响Fig.2 Influence of pH on separation of fatty amines

图3 SDS对脂肪胺标准溶液分离的影响Fig.3 Influence of SDS on separation of fatty amines

表面活性剂[13,14]具有改善电渗流，提高分离效果的作用，本实验加入表面活性剂SDS，出峰时间减少，峰形得到改善，如图3所示。但是高浓度的SDS导致基线噪音增加，综合比较选择SDS浓度为15 mmol/L。

最终确定最优分离条件为：20 mmol/L硼酸盐缓冲溶液(SDS浓度为15 mmol/L，pH为9.2)作为背景电解质，柱温25 ℃，分离电压18 kV。

2.3 线性范围、检出限和重现性

配制系列衍生化的10种脂肪胺，由高浓度到低浓度依次进样分析，依据峰面积对其浓度的变化进行线性回归，得到线性回归方程及相关系数，见表1。在上述最优化条件下进行迁移时间与峰面积重现性考察，通过5次进样实验，迁移时间、峰面积相对标准偏差分别在0.99%～1.65%和0.86%～1.89%之间，见表1。本文方法检出限明显低于谢娟[5]报道的高效液相色谱法测定水产品和水发食品中 4 种脂肪胺检出限。

2.4 实际样品分析

取实际样品3份，一份按“1.2”方法衍生化，直接进行定性定量分析，典型电泳谱图见图4，各组分含量见表2；另两份用标准加入法进行回收率实验，考察方法精密度，见表2。

表1 10种脂肪胺的线性方程、相关系数、线性范围及迁移时间、峰面积相对标准偏差(RSD)

图4 标准溶液(a)和冷冻鲅鱼样品溶液(b)电泳谱图Fig.4 Electropherograms of standard solution(a) and sample solutions of frozen mackerel(b)R.EASC;1.methylamine;2.dimethylamine;3.ethylamine;4.diethylamine;5.propylamine;6.butyl amine;7.pentylamine;8.acetamine;9.heptamine;10.octylamine.

表2 冷冻鲅鱼中脂肪胺含量及回收率

(续表2)

3 结论

实验利用10-乙基吖啶酮-2-磺酰氯(EASC)对10种脂肪胺类化合物进行衍生化，在较短时间内实现了分析物的高效基线分离及检测。建立的方法线性范围宽、重现性好、操作简便、干扰小，是一种适用于冷冻水产品中脂肪胺的定性定量快速检测方法。