杨冰， 高飞， 刘令今， 张尧， 张翠轻， 檀淼， 檀金川

（1.河北中医学院研究生学院，河北石家庄 050000；2.河北中医学院第一附属医院肾病一科，河北石家庄 050000；3.河北医科大学第四医院内分泌科，河北石家庄 050000）

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是引起终末期肾病的主要原因，占全球范围内终末期肾病的30% ～50%[1]，而导致DN 的发生发展是多种病理变化共同的结果，包括细胞外基质蛋白沉积、肾小球基底膜增厚以及电荷屏障丢失、肾小球系膜基质扩张、足突融合消失和足细胞丢失等[2-4]。DN 的发展不仅需要控制血糖升高这一源头，更应警惕疾病发生过程中并发的肾组织纤维化的进展。临床研究显示，丹参多酚酸盐在改善糖尿病患者的早期炎症反应中具有确切的疗效，还可以改善肾功能相关指标以及减轻肾组织纤维化的病理程度，从而延缓慢性肾脏疾病的进展[5-7]。本课题组在前期实验研究中发现，丹参多酚酸盐可以有效抑制或减少膜性肾病大鼠肾小球基底膜免疫复合物的沉积及基底膜的增厚，延缓肾病进展[8-9]。在此基础上，本研究以DN小鼠为模型，进一步从分子水平探讨丹参多酚酸盐改善DN小鼠肾纤维化的可能机制，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物 8周龄清洁级雄性C57BL/6小鼠60只，体质量（20±2）g，购自河北医科大学动物实验中心，动物质量合格证号：SCXK（冀）2018-004。饲养于河北中医学院实验动物中心（室温、湿度、光照适宜），普通饲料喂养。

1.3 仪器 稳豪型血糖仪（强生有限公司）；7170A 全自动生化分析仪（日本日立公司）；Eco 实时定量PCR仪（美国Illumina 公司）；1-15K高速冷冻离心机（美国Sigma 公司）；RM-2126RT 型切片机（上海徕卡仪器有限公司）；CU600恒温水浴震荡器（姜堰市医疗器械有限公司）；BX53光学显微镜（日本Olympus 公司）；DYCZ-24D 型垂直电泳槽（北京六一公司）； Mini-PROTEAN3 电泳系统、Mini Trans-Blot转移系统（美国伯乐公司）。

1.4 分组、造模及给药 将60只小鼠称定体质量并编号按随机数字表随机分为4组，即正常组、模型组、贝那普利组、丹参多酚酸盐组，每组各15 只。适应性喂养1周后，通过连续5 d腹腔注射40 mg·kg-1STZ（溶于0.1 mol/L 柠檬酸缓冲液，pH = 4.0）建立DN 小鼠模型。腹腔注射STZ 5 d 后检测血糖水平，若血糖＞16.7 mmol·L-1则可判断糖尿病模型复制成功，此后每周监测小鼠血糖和24 h尿微量蛋白（24-hour urinary microprotein，UMP）水平。8 周后以UMP ＞30 mg 为DN 模型成功标准[10]。成功造模后，按照成人用药的配伍比例及小鼠与成人的体表面积换算法[11]计算小鼠给药剂量。丹参多酚酸盐组：将注射用丹参多酚酸盐与0.1 mL 生理盐水配成溶液后腹腔注射，剂量为25.9 mg/kg（相当于等效成人剂量200 mg/d），再给予0.2 mL蒸馏水灌胃；贝那普利组：将贝那普利磨成细粉溶于0.2 ml 蒸馏水中灌胃，剂量为1.30 mg/kg（相当于成人10 mg/d），再给予0.1 mL 生理盐水腹腔注射；正常组和模型组：给予等体积蒸馏水灌胃及等体积生理盐水腹腔注射。每日1 次，连续4 周。实验期间各组小鼠均有死亡。

1.5 观察指标与方法

1.5.1 生化指标测定 采用终点法检测尿蛋白浓度，24 h 尿蛋白总量（24h UTP）=尿蛋白浓度×24 h尿量。所有大鼠禁食8 h后尾静脉采血，血糖分析仪检测空腹血糖（FBG）。眼球取血，采用全自动生化分析仪按试剂盒说明方法操作检测血清肌酐（SCr）、BUN水平。

1.5.2 酶联免疫吸附分析（ELISA）检测肾脏组织氧化应激因子SOD、GSH-Px活性及MDA含量 取小鼠肾脏组织匀浆上清液，根据SOD、GSH-Px、MDA ELISA 试剂盒说明书，应用酶标仪于450 nm波长处测定SOD 吸光度值，采用可见分光光度计于420 nm波长处测定GSH-Px吸光度值、于532 nm波长处测定MDA吸光度值。

1.5.3 过碘酸六胺银（PASM）和Masson 染色法观察肾脏病理学变化 用40 g/L的多聚甲醛固定液固定肾组织，常规乙醇梯度脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片（厚度2 μm）、二甲苯脱蜡、乙醇梯度水化后，PASM、Masson 染色，封片，光学显微镜下放大400倍采集图像。

1.5.4 蛋白免疫印迹（Western Blot）法检测小鼠肾脏组织p-Smad2/3、Smad2/3、Smad7 蛋白表达情况 称取100 mg 肾组织，剪碎后置于EP 管内，加入裂解液含细胞酶抑制剂提取蛋白，并测定蛋白含量。取上样蛋白10 ～15 μg，电泳，转膜。室温下用50 g/L 脱脂牛奶封闭。加入一抗，4 ℃孵育过夜。加入二抗，37 ℃孵育1 h。显影。所得结果与内参校正和比较。

1.5.5 逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法检测Smad7、Smad2/3、TGF-β1 mRNA 表达水平 根据说明书，用TRIzol 试剂提取肾脏总RNA，并用PrimeScript 试剂盒进行反转录成cDNA。将cDNA放于荧光定量PCR仪扩增。扩增条件：95 ℃10 min、95 ℃15 s、60 ℃60 s，循环40 次。使用2△△CT法计算目的基因mRNA 表达水平，以β-actin 为内参。引物由北京Servicebio 公司设计合成。β-actin上游引物序列为5’-AGGCCAACCGTGAAAAGATG-3’，下游引物序列为5’-ACCAGAGGCATACAGGG ACAA-3’，扩增片段长度为266 bp；Smad2 上游引物序列为5’-AGGAACAAAAGGTCCGGGGC-3’，下游引物序列为5’-CACTGGCGGAGTGAATGGC A-3’，扩增片段长度为142 bp；Smad3上游引物序列为5’-GGACGCCTGGGCAAGTTCTC-3’，下游引物序列为5’-ATGGACGACATGGCTGGCAC-3’，扩增片段长度为145 bp；Smad7 上游引物序列为5’-CGCGACGAAGAGAGTCTCGG-3’，下游引物序列为GCTGGGGCTGCTCGCATAAG-3’，扩增片段长度为102 bp；TGF-β1 上游引物序列为5’-CGTGCTAATGGTGGACCGCA-3’，下游引物序列为5’-GCAATGGGGGTTCTGGCACT-3’，扩增片段长度为119 bp。

俗话说：“爱子爱在心里。”然而，他爱子是爱在脸上的。有一次，我应邀在其老家作客，吃饭时，大人还没有动筷子，他的大儿子却大口大口地先吃起来，还说：“这是我要吃的，你们不能吃！”一点规矩都没有。然郑君只是轻描淡写地说一句：“老大！客人在，你收敛些好吗！”饭后，我和郑君正在品茶谈天，突然，有一孩子哭着来告状，说是他额头上的乌青块是郑君的大儿子用砖头砸的。郑君连句安慰他的话都没有，却反问那个孩子：“他为什么砸你，而不砸别人呢?”这无疑是在默认、纵容其子的错误行为。

1.6 统计方法 采用SPSS 23.0 统计软件处理数据，所选指标均为计量资料，以均数± 标准差（± s）表示。若数据符合正态分布，组间比较采用单因素方差分析，若数据不满足正态性假设或方差不齐时，则选用秩和检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠一般情况 正常组小鼠毛色光泽，活动自然，饮食饮水量及尿量正常；模型组小鼠毛色晦暗，体质量逐渐下降，出现明显多饮、多食、多尿等表现，造模第6周末，模型组有1只小鼠血糖不达标，予以剔除；丹参多酚酸盐组第6周死亡1只；贝那普利组第7周死亡1只。

2.2 各组小鼠FBG、UTP、BUN、SCr 水平的比较 表1结果显示，与正常组比较，模型组小鼠的FBG、UTP 水平明显升高（P ＜0.05），BUN 和SCr变化不明显，差异无统计学意义（P ＞0.05），提示DN小鼠肾功能受到了损伤；与模型组比较，丹参多酚酸盐组和贝那普利组的UTP 水平显著降低（P ＜0.05），FBG、BUN、SCr 水平无显著变化（P ＞0.05），且2 个治疗组之间比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。表明丹参多酚酸盐组小鼠的肾功能损伤可能得到了改善。

2.3 各组小鼠肾组织中SOD、MDA、GSH-Px水平的比较 表2结果显示，与正常组比较，模型组小鼠肾组织中MDA 含量显著升高，SOD 和GSH-Px活性下降，差异均有统计学意义（P ＜0.05），提示DN 小鼠体内产生了氧化应激反应；与模型组比较，丹参多酚酸盐组和贝那普利组小鼠肾组织中MDA含量不同程度地降低，SOD和GSH-Px活性升高，差异均有统计学意义（P ＜0.05），且2 个治疗组之间比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。表明丹参多酚酸盐能够有效抑制DN小鼠肾脏组织的氧化应激反应。

表1 各组小鼠FBG、UTP、BUN和SCr水平的比较Table 1 Comparison of the levels of FBG，UTP，BUN and SCr in various groups （±s）

表1 各组小鼠FBG、UTP、BUN和SCr水平的比较Table 1 Comparison of the levels of FBG，UTP，BUN and SCr in various groups （±s）

①P ＜0.05，与正常组比较；②P ＜0.05，与模型组比较

组别正常组模型组贝那普利组丹参多酚酸盐组鼠数（只）15 14 14 14 FBG（mmol·L-1）5.32±0.53 27.03±2.67①27.09±3.11①27.12±3.22①UTP（mg·24h-1）2.34±0.15 7.54±0.48①5.37±0.22②4.16±0.18②BUN（mmol·mL-1）10.51±1.54 9.83±1.33 8.84±1.70 9.32±1.56 SCr（μmol·L-1）57.68±3.56 58.24±8.74 54.37±7.72 56.87±6.81

表2 各组小鼠肾组织中SOD、MDA、GSH-Px水平的比较Table 2 Comparison of the levels of SOD，MDA and GSH-Px in mouse renal tissue of various groups （±s）

表2 各组小鼠肾组织中SOD、MDA、GSH-Px水平的比较Table 2 Comparison of the levels of SOD，MDA and GSH-Px in mouse renal tissue of various groups （±s）

①P ＜0.05，与正常组比较；②P ＜0.05，与模型组比较

组别正常组模型组贝那普利组丹参多酚酸盐组鼠数（只）15 14 14 14 SOD（kU·g-1）133.00±11.03 83.54±9.63①101.47±9.59②115.87±10.45②MDA（μmol·g-1）1.19±0.12 1.84±0.18①1.56±0.20②1.44±0.21②GSH-Px（kU·g-1）604.81±53.17 411.78±33.74①490.24±35.95②543.66±39.46②

2.4 各组小鼠肾组织病理变化的比较 图1 中PASM 染色结果显示：正常组小鼠肾内结构较清晰，形状规则，基底膜未见增厚；模型组可见肾小球基底膜增厚，系膜区明显增宽，细胞外基质累积；与模型组比较，丹参多酚酸盐组和贝那普利组小鼠肾组织的病理改变有所减轻。

Masson 染色结果显示：正常组小鼠肾组织球管形体结构清晰无明显异常；与正常组比较，模型组肾小球基底膜显著增厚，有较多的免疫复合物堆积，胶原纤维增多；丹参多酚酸盐组和贝那普利组的病理改变较模型组减轻，2个治疗组之间无明显差异。

2.5 各组小鼠肾组织p-Smad2/3、Smad2/3、Smad7蛋白表达情况比较 图2 结果显示，与正常组比较，模型组的p-Smad2/3 与Smad2/3 比值升高（P ＜0.05），Smad7 蛋白表达明显减弱（P ＜0.05），表明DN 小鼠体内TGF-β1/Smad 信号转导通路被激活。与模型组比较，丹参多酚酸盐组与贝那普利组的p-Smad2/3 与Smad2/3 比值下降（P ＜0.05），Smad7蛋白表达明显增强（P ＜0.05）。表明丹参多酚酸盐可抑制DN小鼠肾组织发生TGF-β1/Smad信号转导通路活化。

2.6 各组小鼠肾组织Smad2/3、Smad7、TGF-β1 mRNA表达水平的比较 表3结果显示，与正常组比较，模型组小鼠肾组织中Smad2/3、TGF-β1mRNA表达水平明显升高，Smad7 mRNA表达水平明显下降（均P ＜0.05）；与模型组比较，丹参多酚酸盐组和贝那普利组均可下调小鼠肾组织中Smad2/3、TGF-β1 mRNA 表达水平，上调Smad7 mRNA 表达水平（均P ＜0.05），且2 个治疗组之间比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。表明丹参多酚酸盐可抑制DN小鼠肾组织TGF-β1/Smad信号转导通路Smad2/3、Smad7、TGF-β1 mRNA的表达。

图1 各组小鼠肾组织病理形态的比较（PASM、Masson染色，×400）Figure 1 Comparison of the mouse renal pathological changes in various groups（by PASM and Masson staining，×400）

图2 各组小鼠肾组织p-Smad2/3、Smad2/3、Smad7蛋白表达情况比较（±s）Figure 2 Comparison of the protein expression levels of p-Smad2/3，Smad2/3 and Smad7 in mouse renal tissue of various groups（±s）

表3 各组小鼠肾组织中Smad2/3、Smad7、TGF-β1 mRNA表达水平比较Table 3 Comparison of the mRNA levels of Smad2/3，Smad7and TGF-β1 in mouse renal tissue of various groups （±s）

表3 各组小鼠肾组织中Smad2/3、Smad7、TGF-β1 mRNA表达水平比较Table 3 Comparison of the mRNA levels of Smad2/3，Smad7and TGF-β1 in mouse renal tissue of various groups （±s）

①P ＜0.05，与正常组比较；②P ＜0.05，与模型组比较

组别正常组模型组贝那普利组丹参多酚酸盐组鼠数（只）15 14 14 14 Smad2/3 1.00±0.00 2.67±0.38①1.76±0.26②1.44±0.22②Smad7 1.00±0.00 0.31±0.04①0.62±0.05②0.71±0.06②TGF-β1 1.00±0.00 4.33±0.64①2.47±0.35②2.12±0.26②

3 讨论

糖尿病肾病（DN）是继发于糖尿病的一种微血管并发症，其主要临床表现为蛋白尿、高血压和肾功能逐渐下降。DN 是一种多因素进展性疾病，其发病机制极其复杂，主要涉及遗传因素、肾脏血流动力学异常、高血糖导致的糖代谢紊乱、氧化应激、炎性反应和细胞因子以及自噬等[12]。在临床上，及时避免糖尿病发展成为DN，延缓肾衰竭，防止纤维化是我们亟需解决的问题。

转化生长因子β1（TGF-β1）/Smad 信号在激活肾小管间质中过量生成细胞外基质的成肌纤维细胞中起重要作用[13]。研究表明，TGF-β1/Smad信号传导可以诱导肾小管上皮细胞向肌成纤维细胞转化，以及募集和诱使骨髓来源的纤维细胞转化成肌纤维母细胞[14]。TGF-β1 是成纤维因子，可通过激活成纤维细胞并抑制基质降解来促进细胞外基质积累[15-16]，也是DN 发病机制的最后共同通路。有研究证实，在DN 患者中，血清及尿中TGF-β1水平均增高，因此，下调TGF-β1信号表达可能是抗肾纤维化治疗的有希望的靶标[17-19]。Smad蛋白是目前所知的TGF-β1受体唯一的胞内激酶底物，介导了胞内信号传导，参与信号通路传导的有Smad2、Smad3、Smad4、Smad6、Smad7 等。在诱导的DN 小鼠肾脏病变过程中，Smad2 和Smad3、磷酸化的Smad2/3与Smad4结合并转移到细胞核中以调节靶基因的转录。TGF-β1 信号通路中的Smad7是主要的负性调节因子[20]，对糖尿病肾损伤具有保护作用，在一定程度上对TGF-β1/Smad 信号传导通路具有负反馈调节作用，其抑制TGF-β1/Smad信号通路已得到公认[21-25]。另外，糖尿病长期的高血糖状态可破坏活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）产生与清除之间的动态平衡，导致机体氧化应激的发生，而氧化应激是DN中一个重要的发病环节[26-27]。有研究[28]证明，ROS 可以激活TGF-β1，糖尿病ROS 水平增高的同时伴随着TGF-β1 水平的明显增高。本研究结果显示，DN模型小鼠肾组织SOD、GSH-Px活性，Smad7 mRNA和蛋白表达水平均较正常组降低，MDA 含量、Smad2/3 的活化水平、TGF-β1 mRNA 表达水平均较正常组升高。表明DN小鼠体内发生氧化应激反应及TGF-β1/Smad信号通路的活化。

中医学并没有“糖尿病”“糖尿病肾病”病名。根据糖尿病的临床表现，中医学将其归属“消渴”范畴，其病机关键在于阴虚内热，而多数医家认为本病在发生发展过程中，形成了本虚标实的病理特征。根据DN的临床表现，可归为“水肿”“关格”“癃闭”“溺毒”等范畴。现代医家认为DN肾纤维化多是肾络瘀阻的结果，当外感浊毒之邪，与内生之邪相合，伏于肾络，阻遏气机，血行凝滞，瘀血内生，痹阻肾络，致肾络瘀阻。湿浊瘀血等病理产物堆积，表现为胶原基质沉积增多；痰湿、浊毒、瘀血等一些病理产物损害了肾脏的正常组织结构，表现为细胞的损伤、凋亡，以及数量的减少；疾病进一步发展则癥瘕形成，可表现为肾小球硬化或肾间质纤维化。

丹参，为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.干燥根及根茎。其味苦，性微寒，入心、肝经，具有活血祛瘀、安神宁心的功效，常用于治疗冠心病心绞痛、癥瘕积聚、心悸、失眠等病症。丹参多酚酸盐是从丹参中提取的有效成分，其主要的活性物质为丹参乙酸镁。为观察糖尿病肾结构和功能变化及丹参多酚酸盐的干预作用，本研究构建了DN小鼠模型，结果显示：模型组小鼠肾脏功能指标UTP、SCr、BUN 水平升高，肾脏组织可见肾小球基底膜增厚，系膜区明显增宽，细胞外基质累积等病理改变，说明DN小鼠出现不同程度的肾结构和功能损害。经丹参多酚酸盐干预后，DN小鼠肾脏功能指标有所降低，受损的肾组织得到明显改善。表明丹参多酚酸盐可以有效改善DN 小鼠肾脏病理损伤，从而调节DN 小鼠的肾脏功能。另外，本研究结果还显示，丹参多酚酸盐可以增加DN 小鼠肾组织抗氧化酶SOD、GSH-Px的活性，降低组织和细胞中氧化产物MDA的蓄积，上调肾组织Smad7 的mRNA 蛋白的表达。表明丹参多酚酸盐可改善DN小鼠体内发生氧化应激反应及TGF-β1/Smad 信号通路的活化状态，最终改善糖尿病小鼠的肾脏病理学改变和肾脏功能。

综上所述，丹参多酚酸盐可以改善DN小鼠肾功能损伤，其潜在机制可能与抑制TGF-β1/Smad信号传导，减少下游转录蛋白胶原的生成，以及抗氧化应激反应，从而减轻肾纤维化有关。本研究结果为丹参多酚酸盐临床治疗DN提供了理论基础。