张俊， 袁映红， 冯志蔚， 肖涛， 孔亮， 蒋科

（1.南充市中心医院嘉陵分院骨科，四川南充 637500；2.川北医学院附属医院骨科，四川南充 637000）

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种慢性全身性自身免疫性疾病，其主要表现为滑膜炎症伴关节软骨及骨质破坏等[1]。调节免疫异常、消除炎症反应是治疗RA的关键[2]。目前对RA的西药治疗主要包括非甾体抗炎药/糖皮质激素等[3-4]，但这些药物均有较大的副作用；单纯中药治疗RA 毒副作用小，但效果并不非常显著[5]。青蒿素是从菊科植物黄花蒿（Artemisiaannua L.全草）中提取的含有过氧基团的倍半萜内酯（药用植物的生物活性组分）的药物。青蒿素及其已上市衍生物是临床常用的抗疟药物。现有研究还发现青蒿素及青蒿素衍生物对体液免疫和细胞免疫均有明显的抑制作用，同时具有较好的抑制炎症效果，且安全性高[6-7]，其作为抗炎免疫调节药物越来越受到重视。双氢青蒿素（dihydroartemisinin）是青蒿素的衍生物之一，是青蒿素经四氢硼钠还原而成，分子式为C15H24O5，相对分子质量为284.35，是青蒿素类药物在体内的主要的活性形式之一。已经有研究表明，双氢青蒿素具有抗RA 作用[8]。本研究建立Ⅱ型胶原诱导RA动物模型模拟RA发病[8]，进一步探讨双氢青蒿素对RA大鼠抗炎反应和软骨修复的影响，以期为RA 患者临床治疗提供参考依据，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物 SPF级6周龄SD雄性大鼠75只，购自广东医学院实验动物中心，粤监证字2018A029号，动物许可证号：SYXK2018-0056。于川北医学院实验动物中心SPF 级动物房中进行常规饲养，自由饮水、进食，温度25 ℃，光照/黑暗各12 h。本实验已经过动物伦理委员会批准同意且本动物实验严格遵循动物实验减少（reduction）、优化（refinement）和替代（replacement）-3R原则。

1.2 药物与试剂 双氢青蒿素（CAS 号：71939-50-9；商品号：EBD2184717）（上海源叶生物科技有限公司）。肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素10（IL-10）、白细胞介素17（IL-17）、白细胞介素23（IL-23）酶联免疫吸附分析（ELISA）试剂盒（上海恒远生物科技有限公司）；成骨细胞特异性转 录 因 子Osterix（Osx）、Ⅰ型 胶 原 蛋 白α1 链（COL1A1）和骨钙素（OC）等抗体（上海艾博抗有限公司）；苏木素、伊红（武汉博士得生物有限公司）；中性福尔马林、酒精、二甲苯（天津科密欧有限公司）；辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔IgG、HRP羊抗鼠IgG等二抗（美国Thermo公司）。

1.3 仪器 YLS-7C足趾容积测量仪（江苏赛昂斯生物科技有限公司）；BS-124s型电子天平（北京赛多斯仪器系统有限公司）；415D 离心机（德国Eppendorf公司）；Dexa Pro-I X 线骨密度仪（徐州品源电子科技有限公司）；LD-66切片机（长沙益广制药机械公司）；SG-51 正显微镜（上海光学仪器厂）；蛋白电泳及转膜仪（美国Bio-Rad 公司）；凝胶成像系统（以色列DNR公司）。

1.4 分组与模型建立 将75 只大鼠适应性喂养1 周后，采用随机分组法将大鼠分为假手术组，模型组，双氢青蒿素低、中、高剂量组，每组各15 只。除假手术组外，其余各组大鼠均给予胶原诱导法构建RA模型，造模方法和判断造模是否成功的标准参考Fujii 等[9-10]研究。具体操作方法：用乙酸溶液溶解Ⅱ型胶原制成胶原溶液2 g/L，将等体积的胶原溶液和不完全弗氏佐剂充分乳化混匀至滴1滴乳剂于蒸馏水水面凝而不散时，示乳化剂配制成功。取400 μg 胶原乳化剂注射大鼠右足跖部皮下致炎，并于造模第14 天同法给予100 μg胶原乳化剂加强免疫。于造模第20 天，应用相机拍照和X 射线拍摄观察大鼠足跖部，以出现严重红肿、连续低密度影及溶骨现象表明造模成功。

1.5 药物干预 于初次免疫21 d，参考文献[11]中的双氢青蒿素给药剂量进行干预，双氢青蒿素低、中、高剂量组大鼠分别对应给予双氢青蒿素6.25 、12.5、25 mg/kg（分别相当于成人用药剂量39.06、78.13、156.25 mg）灌胃处理，假手术组和模型组给予等体积的生理盐水灌胃，每日1次，连续给药2周。

1.6 观察指标与方法

1.6.1 大鼠骨指标检测 末次给药后24 h脱颈处死大鼠，分离出胫骨，置于40 g/L多聚甲醛溶液中固定，依次进行脱钙、脱水处理，石蜡包埋、切片，应用双能X 线骨密度仪测量大鼠骨体积分数（bone volume/total volume，BV/TV）、骨表面积/骨体积（bone surface/bone volume，BS/BV）、骨小梁厚度（trabecular bone thickness，Tb.Th）、骨小梁数量（trabecular bone number，Tb.N）值。

1.6.2 踝关节组织病理学观察 按“1.6.1”项方法制备踝关节组织切片，采用苏木素-伊红（HE）染色法观察踝关节组织病理学表现，阿利新蓝染色法观察踝关节软骨组织蛋白多糖的表达，采用抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色法观察踝关节骨组织破骨细胞情况[12]。

1.6.3 ELISA 法检测外周血中炎症因子TNF-α、IL-17、IL-23和IL-10的含量 处死大鼠后，前颈动脉采血0.5 mL，以1 200 r/min 4 ℃离心10 min，收集上清液。具体操作方法严格按照TNF-α、IL-17、IL-23、IL-10 等ELISA试剂盒说明书进行。

1.6.4 蛋白免疫印迹法检测踝关节组织Osx、COL1A1、OC的表达 末次给药后24 h脱颈处死大鼠，取踝关节置于液氮快速冷冻，制成踝关节匀浆，提取总蛋白并调节各组蛋白浓度相同，依次进行十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离蛋白、转移蛋白至PVDF膜、以50 g/L脱脂奶粉室温封闭2 h、Osx（1∶500）4 ℃孵育过夜、二抗孵育2 h、显影曝光等步骤。最后应用ImageJ 软件分析目标蛋白条带灰度值。COL1A1、OC等指标的检测方法同上。

1.6.5 实时定量聚合酶链反应（RT-PCR）法检测踝关节组织骨吸收功能相关基因OSCA、TRAP 的表达情况 取大鼠踝关节标本，切片机切碎后使用胰蛋白酶消化，使用TRIzol 试剂提取总RNA，测定RNA 浓度和纯度后，用反转录试剂盒合成cDNA，用PCR仪进行扩增。PCR反应条件：95 ℃5 min，95 ℃10 s、65 ℃30 s、72 ℃1 min 进行40 个循环。具体步骤按照试剂盒方法操作。采用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量，以GADPH 为内参。OSCAR上游引物序列为5’-TGTTGGCTGCC GCTCACTTTG-3’，下游引物序列为5’-GACGCT GCTCGCTCCATTCAC-3’；TRAP 上游引物序列为5’- CTGTGCTCTGCGGTCTCA-3’，下游引物序列为5’-TTCGTCGTCCCATCAGTC-3’；GADPH 上游引物序列为5’-CTCAGACACCATGGGGAGGTGA-3’，下游引物序列为5’-ATGATCTTGAGGCTGTT GTCATA-3’。

1.7 统计方法 采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析，采用GraphPad Prism 5 软件作图。计量数据以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步组间两两比较采用LSD 法。以P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠骨指标水平比较 图1 结果显示：与假手术组比较，模型组大鼠骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数量显著降低，骨表面积/骨体积显著升高（均P ＜0.05）；与模型组比较，双氢青蒿素低、中、高剂量组大鼠骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数量升高，骨表面积/骨体积降低，且呈剂量依赖性，其中双氢青蒿素中、高剂量组差异有统计学意义（均P ＜0.05）。

2.2 各组大鼠踝关节病理学表现比较 图2 结果显示：从HE染色结果可见，假手术组大鼠踝关节无炎症和软骨损伤，模型组大鼠踝关节滑膜增生，炎性细胞浸润，软骨损伤严重，使用低、中、高剂量的双氢青蒿素处理后大鼠踝关节炎性浸润显著改善，滑膜增生得到了显著的改善。从阿利新蓝染色结果可见，假手术组大鼠踝关节软骨组织蛋白多糖有较强表达，模型组大鼠软骨组织基本无蛋白多糖表达，使用低、中、高剂量的双氢青蒿素处理后大鼠软骨组织中蛋白多糖表达显著增加。从TRAP染色结果可见，与假手术组比较，模型组大鼠踝关节骨组织破骨细胞明显增多，使用低、中、高剂量的双氢青蒿素处理后大鼠踝关节骨组织破骨细胞数量较模型组明显减少。

图1 各组大鼠骨指标水平比较

Figure 1 Comparison of the levels of bone indexes in rats of various groups

图2 各组大鼠踝关节病理学表现比较（×400）Figure 2 Comparison of the pathological features of rat ankle tissue in various groups（×400）

2.3 各组大鼠外周血中炎症相关因子TNF-α、IL-17、IL-23 和IL-10 含量比较 图3 结果显示：与假手术组比较，模型组大鼠外周血中炎症相关因子TNF-α、IL-17、IL-23和IL-10含量均显著升高（P ＜0.05）；与模型组比较，双氢青蒿素低、中、高剂量组大鼠外周血中炎症相关因子TNF-α、IL-17、IL-23含量降低，IL-10含量升高，且呈剂量依赖性，其中双氢青蒿素中、高剂量组差异有统计学意义（均P ＜0.05）。

图3 各组大鼠外周血中炎症相关因子TNF-α、IL-17、IL-23和IL-10表达水平比较Figure 3 Comparison of the levels of inflammation-related factor TNF-α，IL-17，IL-23，IL-10 in rat peripheral blood of various groups

2.4 各组大鼠踝关节组织成骨标记物Osx、COL1A1、OC 表达情况比较 图4 结果显示：与假手术组比较，模型组大鼠踝关节组织Osx、COL1A1、OC 的相对表达水平显著降低（P ＜0.05）；与模型组比较，双氢青蒿素低、中、高剂量组大鼠踝关节组织Osx、COL1A1、OC 的相对表达水平升高，且呈剂量依赖性，其中双氢青蒿素中、高剂量组差异有统计学意义（均P ＜0.05）。

2.5 各组大鼠踝关节组织骨吸收功能相关基因OSCAR、TRAP 表达情况比较 图5 结果显示：与假手术组比较，模型组大鼠踝关节组织OSCAR、TRAP mRNA 表达水平均显著升高（P ＜0.05）；与模型组比较，双氢青蒿素低、中、高剂量组大鼠踝关节组织OSCAR、TRAP mRNA 表达水平均降低，且呈剂量依赖性，其中双氢青蒿素中、高剂量组差异有统计学意义（均P ＜0.05）。

图5 各组大鼠踝关节组织骨吸收功能相关基因OSCAR、TRAP表达情况比较Figure 5 Comparison of the expression levels of bone resorption function-related gene OSCAR，TRAP in rat ankle tissue of various groups

3 讨论

类风湿关节炎（RA）发病机制复杂，受多种因素的影响，这些因素导致机体免疫调节失衡和过度的炎症反应，从而引起关节结构的破坏。骨体积分数（骨体积/总量）、骨小梁厚度、骨小梁数量主要反映骨组织的密度[13-15]。本研究结果显示：与假手术组比较，模型组大鼠骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数量均显著降低，骨表面积/骨体积显著升高（均P ＜0.05）；从HE 染色结果可见，滑膜增生，炎性细胞浸润，软骨损伤严重；从阿利新蓝染色结果可见，软组织基本无蛋白多糖表达，而经双氢青蒿素干预后上述情况均得到改善。表明双氢青蒿素可显著改善RA软骨损伤情况并提高骨密度。

RA 滑膜组织中炎症因子可通过刺激胶原酶和前列腺素E诱导损伤软骨和骨骼[16]。目前，研究较多的炎症因子主要包括促炎症因子和抑炎症因子，其中，促炎症因子主要由辅助性T淋巴（TH）1细胞分泌，主要包括TNF-α、IL-17、IL-23 等。抑炎症因子主要由TH2 细胞分泌，主要包括IL-10、IL-4、IL-13等。本研究结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠外周血中炎症相关因子TNFα、IL-17、IL-23 和IL-10 含量均显著升高（P ＜0.05），而经双氢青蒿素干预可以调节上述趋势，有效抑制促炎症因子TNF-α、IL-17、IL-23 的升高，促进抑炎症因子IL-10的分泌，表明双氢青蒿素可以改善大鼠滑膜组织炎症反应。

RA 发病伴随软骨、骨质损伤。Osx 为锌指DNA结合蛋白，在骨组织发育中呈高表达，Osx缺失阻碍骨组织形成，是成骨细胞分化和骨形成过程中的重要转录因子[17]。COL1A1 是主要由成骨细胞合成的1 型胶原蛋白，为骨基质组成成分，COL1A1可促进胶原成熟、成骨细胞分化、促进矿物盐沉积，加速骨组织形成[18]。OC 是由成骨细胞合成并分泌的骨钙素，是成熟骨细胞的主要标志物，在成骨细胞分化、骨基质矿化时水平升高[19]。本研究结果显示，RA大鼠骨组织Osx、COL1A1和OC 水平显著降低，而双氢青蒿素干预可下调升高的Osx、COL1A1和OC水平，表明双氢青蒿素可以促进RA大鼠软骨组织修复。

发生RA时，常伴随着骨质疏松和骨质重塑等过程，此过程涉及破骨细胞、成骨细胞，两者分别吸收受损旧骨、形成新骨[20]。当破骨细胞增多、成骨细胞减少，则会出现骨密度减少、关节炎的现象[21]。OSCAR 是破骨细胞相关受体，其水平与破骨细胞数量呈正相关，当OSCAR 水平升高时破骨细胞数量增加，反之则是破骨细胞数量减少。TRAP 是抗酒石酸酸性磷酸酶，是破骨细胞的标志酶，为破骨细胞所特有，当TRAP表达缺乏或者过度时会出现骨硬化和骨质疏松[22]。本研究结果显示，与假手术组比较，RA 大鼠骨组织OSCAR mRNA、TRAP mRNA 相对表达水平显著升高，且破骨细胞增多，而双氢青蒿素干预后，OSCAR mRNA、TRAP mRNA相对表达水平显著降低，且破骨细胞呈降低趋势，表明双氢青蒿素可以促进RA大鼠软骨生长。

综上所述，双氢青蒿素可以通过抑制Ⅱ型胶原诱导RA 大鼠炎症反应，促进软骨修复，改善RA。