杨德政 孙光军 桑维钧

摘要为获得能有效抑制煙草赤星病菌的拮抗菌，通过平板对峙法，筛选出一株对烟草赤星病菌有较强抑制作用的生防菌，通过形态、生理生化特征以及16SrRNA、gyrA序列分析等方法对其进行鉴定，并对其生长条件进行优化。结果表明，Y6菌株对烟草赤星病菌有较好的抑制作用，其与贝莱斯芽孢杆菌（BacillusvelezensisLF01）的同源性最高，形态和生理生化特征与贝莱斯芽孢杆菌基本相符。经过测试，Y6菌株的最佳培养条件：温度30°C、pH6.0、转速180r/min，碳源选择葡萄糖，氮源选择酵母膏。该试验结果可为贝莱斯芽孢杆菌在生产工艺中的应用提供参考。

关键词烟草赤星病;贝莱斯芽孢杆菌;筛选鉴定;生长条件

中图分类号S435.72文献标识码A

文章编号0517-6611（2021）08-0130-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.08.034

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Screening，IdentificationandGrowthConditionOptimizationofanAntagonisticBacteriaStrainY6againstTobaccoBrownSpot

YANGDe-zheng1，SUNGuang-jun2，SANGWei-jun1，3（1.CollegeofTobacco，GuizhouUniversity，Guiyang，Guizhou550025;2.GuizhouBranchofChinaTobaccoCorporation，Guiyang，Guizhou550025;3.GuizhouKeyLaboratoryforTobaccoQualityStudy，GuizhouUniversity，Guiyang，Guizhou550025）

AbstractInordertoobtaintheantagonisticbacteriastrainwhichcouldeffectivelyinhibittobaccobrownspotdisease，thebiocontrolbacteriawerescreenedbygrowthinhibitionmethodonmedium.Isolatedstrainswereidentifiedbymorphological，physiologicalandbiochemicalcharacteristics，aswellas16SrRNAandgyrAsequence.Theirgrowthconditionswereoptimizedafterward.TheresultsshowedthatY6strainhadstronginhibitoryeffectonAlternariatabacionmediumplate，andhadthehighesthomologywithBacillusvelezensisstrainLF01.Itsmorphological，physiologicalandbiochemicalcharacteristicswerebasicallyconsistentwiththatofBacillusvelezensis.TheoptimumcultureconditionsofY6wereasfollows：30°C，pH=6.0，180r/min，carbonsourceglucose，nitrogensoureyeastextract.ThetestresultscanprovidevaluablereferenceforthemassproductionprocessofBacillusvelezensis.

KeywordsTobaccobrownspotdisease;Bacillusvelezensis;Screeningandidentification;Growthcondition

烟草赤星病是由链格孢菌属的几种真菌（Alternariaspp.）引起的一种病害，主要发生于烟草生长中后期，是烟草叶片的主要病害之一，具有潜育期短、流行速度快等特点，直接影响烟叶的品质和产量[1]。赤星病1892年在美国首次被报道，1916年在我国北京附近发现后，80年代初我国各大烟区都出现了此病，给烟草行业造成了巨大损失[2]。利用生物防治来防治烟草赤星病是一种有效且具有较大发展潜力的防治方法，周棱波等[3]从健康烟叶上分离出了对烟草赤星病病原菌具有较好拮抗作用的短芽孢杆菌B12，其在离体叶片上的防效达66.7%。马志远等[4]利用平板对峙法从烟草根际土壤和烟草叶围上筛选出了一株解淀粉芽孢杆菌，其在烟草赤星病菌上抑菌条带宽度为14.2mm，在用该菌的活性物质粗提物与烟草赤星病病原菌孢子液进行抑制试验后，发现粗提物对病原菌孢子的萌发抑制率高达85.6%。笔者从烟草根际土壤中筛选到了一株对烟草赤星病病原菌有一定拮抗作用的细菌菌株Y6，通过16SrRNA、gyrA基因序列、形态学和生理生化特征分析，确定其种类，并对其发酵条件进行优化，为评价该菌株是否能成为烟草赤星病生防菌提供参考，同时丰富了防治赤星病的微生物资源。

1材料与方法

1.1试验菌株烟草赤星病病原菌，由贵州大学烟草学院桑维钧教授提供;Y6分离自贵州省遵义市绥阳县浦场镇有赤星病严重病害发生的烟田根际土壤中。

1.2培养基及试剂盒马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA），用于赤星病菌的生长培养;Luria-Bertani培养基（LB），用于Y6菌株的分离和培养;碳源基础培养基：酵母膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL;氮源基础培养基：优化后的碳源5g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL。百泰克细菌基因组DNA提取试剂盒;PCR引物及反应试剂，由生工生物技术有限公司合成。

1.3拮抗菌的分離将采自上述地点的土样各取一小部分充分混匀，称取10g，放入盛有90mL无菌水的250mL三角瓶（有玻璃珠）内，放在摇床上充分振荡（180r/min）静置后，用移液器吸取1mL土壤悬液加至盛有9mL无菌水的大试管中混匀，即为10-1稀释液。同样方法，制成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6土壤稀释液。用移液器取200μL的10-4、10-5、10-63个稀释度的土壤悬液放在LB培养基平板上，用灭过菌的涂布棒涂匀。28℃培养24h，挑出形态大小不同的单菌落，用平板划线法纯化，移接在新的LB培养基平面上培养及保存。

1.4拮抗菌的筛选拮抗菌的初步筛选利用平板对峙法[5]。在PDA培养基中央接入直径5mm的烟草赤星病菌菌落，在赤星病菌四周20mm处接待测细菌，细菌接种点的位置与赤星病菌相对呈十字形，在培养皿底部标记各菌株编号。28℃培养5d后观察是否出现抑制效果。复筛采用上述同样方法，培养5d后观察抑菌效果。

1.5拮抗菌的鉴定

1.5.1形态特征和生理生化特征。用平板划线法将菌种接种于平板培养基上，28℃培养24h，按常规方法观察菌落形态（大小、形状、边缘、表面、凹凸度、透明程度和菌落及培养基颜色等），并进行革兰氏染色。

参照《常见细菌系统鉴定手册》[6]、《伯杰细菌鉴定手册》（第9版）[7]对菌株进行生理生化鉴定，包括碳源利用、葡萄糖氧化发酵、硝酸盐还原、甲基红、V.P试验、淀粉水解反应、明胶液化反应测定、H2S的产生等试验。

1.5.216SrDNA序列分析。采用百泰克细菌基因组DNA提试剂盒提取，使用细菌16SrDNA通用引物[8]27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）、1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）进行PCR扩增。PCR反应体系：上、下游引物各1μL，12.5μL2×PCRMastermix，9.5μLddH2O，1μLDNA模板，共计25μL。PCR扩增程序：94℃5min，94℃30s，54℃退火30s，72℃90s，35个循环，72℃7min。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测后送上海生工进行Sanger测序，结果在NCBI上进行BLAST相似序列检索比对，将待测拮抗菌确定到属。

1.5.3gyrA序列分析。采用前一步提取的DNA，使用gyrA引物[8]gyrA-5P（5′-CAGTCAGGAAATGCGTACGTCCTT-3′）、gyrA-3P（5′-CAAGGTAATGCTCCAGGCATTGCT-3′）进行PCR扩增。PCR反应体系同“1.5.2”。PCR扩增程序：94℃5min，94℃30s，53℃退火30s，72℃90s，35个循环，72℃7min。PCR产物经电泳检测后进行Sanger测序。从NCBI的GenBank下载芽孢杆菌属的gyrA序列6条，以链球菌（Streptococcus）作为外祖，采用mega7.0软件进行Muscle多序列同源性分析，并通过邻接法构建系统进化树。

1.6种子液的制备将筛选出的拮抗菌接种至LB培养液中培养，30℃、180r/min下培养24h待用。

1.7生长曲线测定将液体种子液按1%的接种量接入装有100mLLB培养液的三角瓶中，在30℃、180r/min下培养，每隔2h取样一次，测定600nm的光密度值（OD600）。

1.8拮抗菌生长条件优化

1.8.1不同温度对拮抗菌生长的影响。将种子液按照1%的接种量接种于100/250mL的LB培养液（pH7.0）中，分别放置于不同温度（20、25、30、35、40℃）的恒温培养箱（180r/min）培养，以不加种子液的LB培养液为对照，每个处理重复3次，24h后测定其在波长600nm下的OD值。

1.8.2不同pH对拮抗菌生长的影响。将灭菌后的LB液按每瓶100mL装入三角瓶中（250mL），分别将pH调至3、4、5、6、7、8、9、10、11。将菌悬液按1%接种量接种于不同pH的培养液中，按上一步试验结果调整恒温振荡培养箱温度，恒温振荡培养（180r/min），24h后测定其在波长600nm下的OD值，以不加种子液的LB培养液为对照，每个处理重复3次。

1.8.3不同转速对拮抗菌生长的影响。以上述2步的结果调整LB培养液的pH及培养箱的温度，将种子液按照1%的接种量接种于调制好的pH培养液中，分别放入不同转速150、180、210r/min恒温振荡培养箱中培养24h后，测定其在波长600nm下的OD值，以不加种子液的LB培养液为对照，每个处理重复3次。

1.8.4不同碳源对拮抗菌生长的影响。将不同碳源（麦芽糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露醇）按照10g/mL加入碳源基础培养基中，按照上述三步的结果调整培养液pH与振荡培养温度和转速，将菌悬液以1%的接种量分别接种于灭好菌的碳源培养基中，恒温培养，以不加种子液的碳源基础培养液为对照，每个处理重复3次，24h后测定其在波长600nm下的OD值。

1.8.5不同氮源对拮抗菌生长的影响。将不同的碳源（牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米粉）按照10g/mL加入氮源基础培养基中，按照上述三步的结果调整培养液pH、振荡培养温度、转速、碳源，将种子液以1%的接种量分别接种于灭好菌的氮源培养基中，恒温培养，以不加种子液的氮源基础培养液为对照，每个处理重复3次，24h后测定其在波长600nm下的OD值。

1.9数据处理采用DPS数据处理系统单因素方差分析法的Duncans新负极差法进行数据分析和差异显著性检验（P<0.05），利用MicrosoftExcel2010软件进行作图。

2结果与分析

2.1拮抗菌的筛选通过初筛获得21株具有拮抗作用的菌株，对这21株菌进行复筛后，有6株菌对烟草链格孢有一定的抑制作用。其中Y6对烟草链格孢菌的抑制作用明显，故对Y6进行进一步研究。

2.2拮抗细菌种类鉴定

菌株Y6在LB培养基上28℃培养24h后，菌落为乳白色，呈圆形，直径在0.35～0.55cm，表面有褶皱，中间部分凹陷呈火山状，边缘为锯齿状，不透明（图1）。生理生化结果见表1。

以此菌株的基因组DNA为模板，PCR扩增后经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，产物长度约在1000bp，菌株的16SrDNA、gyrA序列经测定，分别为1076和1001bp。

将该16SrDNA序列进行BLAST分析，结果发现，该序列与芽孢杆菌属菌株具有较高的相似率，能够确定该菌株属于芽孢杆菌属（Bacillus.sp），但不能根据BLAST确定到种。

为了确定Y6的种，首先将Y6菌株的gyrA序列于GenBank中进行Blast分析，结果表明，该序列与贝莱斯芽孢杆菌（B.velezensis）具有非常高的相似性。然后利用从GenBank中下载的7条序列构建系统进化树（图2），结果表明Y6菌株与贝莱斯芽孢杆菌（B.velezensis）的菌株LF01（CP058216）在同一分支上，该分支可信度为90%，与其他几个种，如16SrDNA的Blast结果不能区分的解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）都有一定距离。

2.3菌株Y6生长曲线

Y6菌株的生长曲线见图3，接入LB培养基10h后该菌株的OD600快速上升，进入对数生长期，18～20h为对数期末期，OD600达到最大，20h后菌体数量趋于稳定，OD600基本稳定。由此可知，该菌生长速度较快，接种培养18h后达到最大。

2.4菌株Y6的生长条件优化

2.4.1不同温度对Y6菌株生长的影响。由图4可知，温度在20～35℃时，Y6菌株的OD600均能达到2，说明长势较好。其中，在温度30℃时OD600显著高于其他温度，说明该温度最适宜Y6菌株生长。

2.4.2不同pH对Y6菌株生长的影响。由图5可知，在培养温度为30℃时，在参加测试的pH范围内，在pH5～8时，Y6菌株可以生长，OD600均能达到2，pH为3、4、9、10时菌株几乎不能生长，OD600接近于0，其中，pH6时生长最好，增减pH其OD600显著降低。

2.4.3不同转速对Y6菌株生长的影响。由图6可知，在30℃、pH6的条件下，培养箱转速为180r/min时OD600显著高于150和210r/min，因此，180r/min是最适应Y6菌株的培养条件。

2.4.4不同碳源对Y6菌株生长的影响。由图7可知，麦芽糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露醇均能被Y6菌株利用，其中葡萄糖的利用率最高，OD600达3.04，且显著高于其他4种，麦芽糖与甘露醇次之，果糖的利用率最低，OD600为1.3，且显著低于其他。

2.4.5不同氮源对Y6菌株生长的影响。由图8可知，参与测试的4种氮源，Y6菌株能够较好地利用牛肉膏、蛋白胨、酵母膏3种，其中酵母膏的利用率最高，OD600达3.18，且显著高于其他，牛肉膏次之，基本不能利用玉米粉生长，OD600接近于0。

3结论与讨论

拮抗细菌在植物病害的生物防治中起着非常重要的作用。其中芽孢杆菌具有较高的生防潜力，所产生的芽孢有耐热抗逆的特性，有利于生防菌剂的生产、剂型加工和菌种在工业生产的环境中存活，是植物病害生防微生物的重要组成部分[9]。

贝莱斯芽孢杆菌是2005年由Ruiz-Garcia等[10]新命名的芽孢杆菌属的一个新种。贝莱斯芽孢杆菌能通过产生抗菌蛋白[11]、脂肽类抗生素[12]等物质来抑制病菌。研究表明贝莱斯芽孢杆菌对棉花黄萎病菌[11]、白菜黑斑病菌[13]、香蕉枯萎病菌[14]、西瓜枯萎病菌[15]等有拮抗作用。此外，還发现贝莱斯芽孢杆菌能促进胡椒、马铃薯、萝卜、南瓜、番茄、萝卜、芝麻等作物的生长[16]。

该研究从烟田土壤分离得到对烟草赤星病有抑菌效果的Y6菌株，根据形态和生理生化特征，结合16SrDNA、gyrA2个位点序列的比对确定为贝莱斯芽孢杆菌（B.velezensis）。经过测试，Y6菌株的最佳培养条件为温度30℃、pH6、转速180r/min，Y6菌株能利用多种碳源和氮源，其中碳源为葡萄糖、氮源为酵母膏时生长最好。碳源利用的结果与罗楚翔等[17]的研究中碳源蔗糖最优，葡萄糖其次的结果不同，可能是因为贝莱斯芽孢杆菌株菌之间的个体差异造成的。在氮源利用的试验中，Y6菌株在玉米粉为氮源的培养液中几乎不能生长，这可能是因为加入玉米粉后，培养液浓度过高，阻碍了菌株的生长。

该试验结果为烤烟赤星病的绿色防控提供了新的选择，相关培养条件也是普通生产条件下能达到的，为该菌株的生产工艺提供了参考数据，也为进一步研究菌株抑制的作用机制、活性物质的提取及实际防治效果奠定了基础。

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