肖恩星 曾文静 曾彦达 张启军 冯昊

摘要对一份引自美国的水稻资源（编号为GSOR643131，2012年正季播种编号为128272，简写为8272）进行观察分析，发现该资源在较高温光条件下叶片发生不可逆的黄化，叶绿素含量明显下降;利用8272/9311杂交F2群体，明确了该性状受一个隐性核基因控制，并初步定位在水稻第4染色体SSR标记RM16931与RM16942之间，其遗传距离分别为0.8和3.3cM。进一步设计引物和扩大F2分离群体，将该基因定位在RM16931与InDel标记ID42之间约117kb的区间内;通过对8272和9311的重测序数据在引物区间进行SNP差异性筛选和候选基因的GO分析，結果表明，BGIOSGA015140基因可能是引起8272黄化性状的候选基因。通过该研究可为解析水稻叶色变化机制奠定一定的基础。

关键词水稻;黄化突变体;基因定位;筛选

中图分类号S511;S326;[Q37]文献标识码A

文章编号0517-6611（2021）08-0094-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.08.025

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

ScreeningoftheCandidateGenesforaRiceLeafChlorosisMutant8272

XIAOEn-xing1，ZENGWen-jing2，ZENGYan-da1etal（1.InstituteofFoodCrops，JiangsuAcademyofAgriculturalScience，Nanjing，Jiangsu210014;2.CollegeofLifeScience，ChinaWestNormalUniversity，Nanchong，Sichuan637009）

AbstractAriceresource8272（GSOR643131）introducedfromtheUnitedStates，wasfoundthattheleaveswereirreversiblyyellowingunderhightemperaturecompaniedwithhighlightintensity，itschlorophyllcontentwassignificantlyreduced.F2（8272/9311）populationconfirmedthatthistraitwasregulatedbyasinglerecessivenucleargene.Firstly，thisgenewaslocatedbetweenRM16931andRM16942onthechromosome4ofrice，andwiththegeneticdistanceof0.8cMand3.3cM，respectivelytothetwomarkers.Secondly，itwaslocatedinasectionabout117kbbetweenRM16931andIndelmarkerID42usingnewprimersandabiggerF2population.Finally，re-sequencingdataandSNPdifferentialscreeningof8272and9311showedthatBGIOSGA011540genemightbethecandidategene.Thisstudymaylayacertainfoundationforfurtherresolutionofthericeleafcolorchangingmechanism.

KeywordsRice;Leafyellowingmutant;Genemapping;Screening

水稻（OryzasativaL.）不仅是我国乃至全世界人民的粮食作物，还是单子叶植物功能基因组研究的模式作物[1-2]，由于植物叶色变化容易辨认，故与水稻叶色相关的表型也被不断发现与报道[3]。在早期，叶色突变体不被研究者重视，主要是因为大多数叶色突变体植株体内叶绿素的生物合成或者降解过程受到突变基因调控后其效率一般会下降，进而导致突变体植株的产量下降，严重时可导致植株死亡[4]。近年来，随着分子生物学技术的迅猛发展，不断被挖掘的水稻叶色突变体在探索植株的光合、生理等方面发挥着更大的作用[5]，而且叶色还作为颜色标记在杂交水稻的制种过程中起到去杂保纯的作用，为水稻良种繁育和杂交种的生产提供了新的育种思路[6-8]。一些研究还表明，叶色突变体在植物的光合作用[9]、光形态建成[10]、激素生理[11]、核-质基因互作以及信号传导途径[12]等方面也具有研究价值，甚至可应用到水稻高光效育种[13]中。因此，对水稻叶色突变体材料不断进行深入的发掘与研究，对水稻光合生理探索及其利用均具有较为重要的意义。

从美国引进的水稻材料8272（编号为GSOR643131，2012年正季播种编号为128272，简写为8272）在南京5月初播种，种植过程中发现在7月上旬梅雨结束、迎来高温强光的生长条件下，叶尖由绿开始黄化，黄化后的性状不再转绿而伴随着整个生育期。该研究用该突变体材料与全生育期叶色正常的籼稻9311进行杂交，对后代进行遗传分析，通过水稻SSR和Indel标记对控制该突变体性状进行基因定位，对候选基因进行SNP位点差异和GO分析，为该基因的图位克隆与功能研究奠定基础。

1材料与方法

1.1试验材料

突变体8272是2012年从美国引进资源（编号为GSOR643131，2012年正季播种编号为128272，简写为8272）中发现的叶色黄化突变体，在较高温光前叶片表现为正常的绿色，在一段时间较高温光后8272的叶尖颜色从上至下逐渐变黄，而籼稻9311在黄熟前都表现为正常的绿色。利用8272与9311进行正反交配组，制备F1，并自交后繁衍为F2群体。在江苏省农业科学院自有的水稻基地分别配制和种植以上试验材料。

1.2试验方法

1.2.1色素含量测定。

选取8272和9311的幼苗期（正常绿色）和抽穗期（8272叶尖已黄化）2个阶段进行色素含量的测定，称取剪去中脉的新鲜叶片0.02g放入10mL的离心管中，加入95%乙醇后置于4℃冰箱中浸提24h。随后取一定量的浸提液于比色杯中，并以95%乙醇作为对照，分别测定波长为665、649和470nm下的吸光度。参照Lichtenthaler[14]的方法计算叶绿素a（Chla）、叶绿素b（Chlb）和β-胡萝卜素（β-Car）的含量，计算公式为：Chla=13.95D665-6.88D649;Chlb=24.96D649-7.32D665;β-Car=（1000D470-2.05Chla-114Chlb）/245。叶绿素浓度为叶绿素a和叶绿素b二者之和。叶绿体色素含量=色素浓度（mg/L）×提取液体积（L）/样品重量（g）。

1.2.2遗传分析。

1.2.2.1基因初定位。利用8272/9311F2群体中207个隐性单株作为初定位群体。选取多态性丰富的160对均匀分布在水稻12条染色体上的SSR引物对亲本8272与9311的DNA进行多态性分析，筛选出在二者之间具有多态性的引物，随后对通过集团分离分析法构建的黄化与绿色近等基因池，即在该F2群体抽穗期，选取正常绿色植株和叶尖黄化明显的植株各10株，提取基因组DNA后各取等量混匀分别作为绿色和黄化近等基因池备用，进行PCR分析，将在2个近等基因池上具有多态性差异的SSR标记用于8272/9311F2群体中207个黄化隐性单株进行遗传分析，最后计算连锁标记与控制8272高温光下叶尖黄化基因之间的遗传图距。

1.2.2.2精细定位。

首先，扩大定位群体，最终该研究选用了8272/9311F2群体的1586个黄化单株用于精细定位。其次，在初定位区间进行新SSR引物筛选，同时开发初定位目标区段内在8272与9311之间存在多态性的InDel标记。

InDel标记的开发是根据水稻粳稻品种日本晴与9311基因组序列比对之间已有的InDel差异位点找到在9311基因组中的对应位点，然后在差异位点前后各取500bp的序列，利用引物设计软件PrimerPrimer5.0设计新引物，合成后用于8272与9311之间的基因组扩增、筛选，并把二者之间具有多态性差异的InDel引物用于交换单株的连锁分析。

1.2.3候选基因筛选与测序验证。

提取8272基因组DNA送安诺优达基因科技（北京）有限公司进行全基因组重测序，测序深度要求50倍以上。然后比对8272和9311在精细定位结果的区段内碱基序列，以及目标区段内SNP位点差异和所有基因的GO分析，筛选出候选基因;随后对候选基因重新合成引物进行差异位点的验证，比较分析候选基因编码区在8272与9311和日本晴之间是否发生碱基插入、缺失或替换。

2结果与分析

2.18272农艺性状表现

2012年5月10日播种，6月10日移栽，水稻种质资源8272在7月10日前与对照9311的叶色都表现为正常绿色，随着南京梅雨季节的结束，日均温和光照强度的逐渐升高，8272的所有新生叶尖开始变黄，并一直持续到整个生育期而不再发生转绿现象;且环境温光越高、越强，黄化性状越明显，而此时对照9311仍为正常绿色（图1）;8272在苗期一般表现为绿色，但若在强光照条件下，也会表现出叶尖黄化现象。

2.2高温光条件下8272色素含量

通过对比8272和9311叶片黄化前后几种色素含量（表1）可以看到，8272的叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的含量在不同发育时期都比9311略低，而在后期高温高光强生长条件下更低：在黄化前，8272叶绿素的含量仅比9311低5.9%，类胡萝卜素含量低3.9%;而在黄化后，8272叶绿素含量比9311低65.6%，类胡萝卜素含量也低54.3%。由叶片颜色正常过渡到叶色黄化，8272叶绿素含量和类胡萝卜含量均大幅度下降，分别下降63.4%和54.7%;而9311的叶绿素含量却略有升高（升高1.1%），而类胡萝卜素的含量也仅下降4.8%。在2个生长发育时期，8272的叶绿素与类胡萝卜素的比值虽然均小于9311，但在抽穗期8272的比值下降了19.3%，而9311却上升了6.1%。

2.3基因定位与候选基因筛选

8272与9311的正反交F1在整个生育期均表现为与9311一致的正常绿色。在8272/9311F2群体后期发生叶色分离，正常绿色植株和黄化叶色植株2018年分别为981和326株，2019年分别为4742和1586株。经χ2检验（χ2<χ20.05=3.84;P>0.05），正常叶色与黄化叶色分离比在2年中均符合3∶1，说明8272在高温光下叶尖逐步黄化的性状受一个隐性核基因控制（表2）。

选取160对均匀分布在水稻12条染色体上多态性丰富的SSR引物，在亲本9311与8272基因组之间进行筛选，结果有36对引物在9311与8272基因组间表现出多态性。利用BSA法，将36对引物在黄、绿叶近等基因池上筛选，发现位于水稻第4染色体上的RM16335和RM17401这2个分子标记表现出多态性差异，随后用8272/9311F2群体中随机选择的207个黄化单株作为初定位的连锁分析。根据已公布的公共数据库中水稻SSR标记，在RM16335与RM17401之间每间隔2～6cM选择、合成引物进行亲本和近等基因池间的多态性筛选，并将满足条件的引物进行群体的PCR检测与连锁分析，初步将控制8272的高温高光强叶尖黄化性状的基因定位在标记物理距离为13.8Mbp的RM16720与RM17401之间（图2）。

為了对调控8272黄化性状的目标基因进一步定位，该研究扩大了种植8272/9311的F2群体。同时在初定位的基础上进一步加密SSR引物，并选用PrimerPrimer5.0软件不断设计新的InDel标记。2019年，选用了8272/9311的F2群体中1586个黄化单株进行群体的分子检测与连锁分析，采用染色体步移法进一步缩小目标基因的定位区间，最终将目标基因定位在物理距离约为117kb的SSR标记RM16931与InDel标记ID42之间（图2）。

根据精细定位结果，该研究首先确定RM16931和ID42在9311基因序列中的位置，然后结合8272重测序和9311基因组测序数据，通过一系列软件对RM16931与ID42区间进行二者间基因组DNA序列的SNP差异性筛选，结果发现在这2个引物区间内有5个基因存在SNP差异位点，随后对其GO分析，发现其中3个基因可能与8272的黄化表型有关。

根据9311基因组数据重新设计引物、扩增、测序验证发现，3个候选基因中只有BGIOSGA015140可能存在有义突变，而其他2个候选基因在9311与8272之间不存在非同义突变SNP位点。测序比对结果表明BGIOSGA015140基因在9311与8272之间存在3处SNP位点差异（图3）：18029043处T-C碱基替换的结果是氨基酸同义突变（Tyr-Tyr）;18029050处G-A碱基替换导致氨基酸由缬氨酸（Val）突变为异亮氨酸（Ile），且这2处碱基替换均发生在基因的内含子中;SNP位点（18029492）则位于BGIOSGA015140基因中第20个外显子的编码区（18029272～18029543），A-C碱基替换导致编码的氨基酸由丝氨酸（Ser）变为丙氨酸（Ala）;丝氨酸是亲水性的氨基酸，属于极性中性氨基酸;而丙氨酸则是疏水性的氨基酸，属于非极性氨基酸。由于氨基酸亲、疏水性的改变可能会影响到蛋白质的二级结构，故推测BGIOSGA015140基因中SNP位点（18029492）A-C碱基的替换可能与8272的黄化表型有关。

3讨论

8272在黄化表型上与其他叶色突变体有所区别。一些黄化表型仅在苗期表现，一些则随着生育进程以及后期温度升高逐渐恢复为绿色，一些则在苗期就出现死亡现象[4-7，15-16]。突变体V5在气温低于24℃时表现为黄色，当温度高于26℃时又逐渐表现为绿色[17];突变体W4、W11在25℃时表现为黄色，而在30℃环境下则表现为白色[18];突变体cde1在23℃时表现为绿色，而在26℃时则表现为黄色[19]。8272在环境日均温度低于25℃和中等强度光照时，叶尖表现为正常的绿色，而当日均温高于25℃和/或强光照（>30000lx）时，植株叶尖才开始黄化，且环境温度越高和/或光照越强，黄化性状越明显;虽然在生长后期气温逐渐下降，但是黄化后的叶尖以及其后新生叶片叶尖都呈现出黄色，其黄化特征持续整个生育期。

控制8272叶色随温度变化的基因位置与已报道的黄化突变体有所不同。一些突变体在不同温度条件下会发生表型的变化，如V5[17]，W4、W11[18]，cde1[19]等这些温度敏感叶色突变基因位于水稻第3染色体;而该研究定位结果表明，调控8272叶色黄化的目标基因则位于水稻的第4染色体上，故推测该基因可能是一个控制水稻叶色变化的新基因。

基因编码区单个碱基的改变同样也能导致水稻叶色的变化。突变体cde1在不同温度环境下叶色变化的原因在于突变体内编码谷氨酰胺-tRNA合成酶OsGluRS基因编码区内一个苏氨酸（Thr）被替换为一个脯氨酸（Pro）的错义突变，结果导致高温条件下突变体叶绿体发育不完整[19];突变体TCM5是由于基因LOC_Os05g34460编码区内一个核苷酸T替换为G，导致翻譯的氨基酸改变[20];yl1-1突变体是由于基因LOC_Os02g05890的第4个外显子中有一个碱基由C替换为T，导致编码的氨基酸由脯氨酸替换为丝氨酸[21];ygl8

突变体是由于基因LOC_Os01g17170有一个碱基由A突变为T，导致编码的氨基酸由天冬酰胺变为丝氨酸[22]，这些单个碱基的改变最终导致表型的变化。氨基酸的亲、疏水性的变化及其相互作用对于维持蛋白质的二级和三级结构都具有重要影响[23-24]，因为氨基酸的亲、疏水性的改变可能导致蛋白质疏水面积减小、蛋白折叠过于紧凑、主链张力过大、静电力破坏等变化[25]。通过Blast、Clustal等软件和候选基因GO分析发现，8272中BGIOSGA015140基因编码区SNP变异位点（18029492）由碱基A突变为C，导致编码的氨基酸由疏水性的丝氨酸（Ser）突变为非极性丙氨酸（Ala）;同时，对候选基因BGIOSGA015140上下游区域进行GO分析，并未发现有已报道的与水稻黄化叶色相关的基因。因此，该研究把BGIOSGA015140列为调控8272在不同环境条件下叶尖颜色变化的候选新基因。

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