严明帅，徐业芬，张冯禧，索朗斯珠，牛家强

（1.西藏农牧学院动物科学学院，西藏 林芝860000；2.西藏农牧学院西藏高原动物疫病研究自治区高校重点实验室，西藏 林芝860000）

牛支原体归属于支原体科支原体属，是造成牛呼吸道疾病的重要病原之一［1］。除了可以导致犊牛肺炎、关节炎和奶牛乳腺炎外，还可以造成角膜结膜炎、中耳炎、生殖道炎症、流产与不孕等疾病［2］。牛群感染以后很难彻底根除，带菌状态可达数月甚至数年，其主要传播途径通过飞沫经呼吸道传播，还可以通过近距离接触、生殖道接触和吮吸乳汁等途径传播［3］。Hale等［4］在1961年首次从患乳腺炎的病牛中分离到牛支原体，此后在欧洲等地流行并对养牛业造成巨大的经济损失。在中国，陈嘉棣等［5］在1983年首次从患有乳房炎的牛乳中分离到牛支原体，之后有零星报道牛支原体的感染。辛九庆等［6］在2008年从患肺炎的犊牛肺脏中分离到牛支原体，此后牛支原体在中国部分地区普遍流行，并造成一定的经济损失，石磊等［7］、冉智光等［8］、姚永进等［9］相继报道于患病肉牛及奶牛体内分离并鉴定得到牛支原体，除原发性感染发病外，牛支原体还可以与其他病原造成混合感染，对中国养牛业危害极大。

牛支原体胞质内含有双股DNA和核糖体，基因组很小，大约为1 080 kb［10］，其基因组携带的信息量和生物的合成以及代谢能力十分有限，因此培养牛支原体的人工培养基中需要添加其生存所必需的营养物质［11］，除了在培养基中添加脂肪酸和核酸前体外，还需要加入一定量的血清，为其生长提供所需的胆固醇和脂肪酸，还要添加葡萄糖和丙酮酸作为其能量来源［12］。目前实验室用于培养牛支原体经常使用的培养基存在培养时间长、成本较高等问题，不利于牛支原体的大量培养［13］。本试验选用3种类型的血清和4个厂家生产的琼脂，按照含量为5%～15%的血清添加量制备9种液体培养基；在添加血清类型和含量的基础上制备4种固体培养基，来验证其对牛支原体的生长影响，为今后牛支原体培养基的筛选和疫苗的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

牛支原体分离株由西藏高原动物疫病研究自治区高校重点实验室分离、鉴定与保存［14］。

1.2 主要试剂

PPLO Broth、Yeast Extract、Agar均 购 自BD公司；丙酮酸钠购自青岛海博生物技术有限公司；马血清购自Hyclone公司、猪血清购自上海恒远生物科技有限公司、胎牛血清购自广州蕊特生物科技有限公司；氢氧化钠购自天津市致远化学试剂有限公司；青霉素钠购自山东聖旺药业股份有限公司；琼脂购自上海某公司、成都某公司、香港某公司。

1.3 试验用溶液的制备

0.1 moL/L NaOH溶液：用天平称取4 g NaOH，之后转移到烧杯内，加入少量去离子水使其溶解，完全溶解后转移到容量瓶中定容至1 000 mL，摇匀后4℃保存，备用。

0.4%酚红溶液：用天平称取酚红0.4 g放入研钵内、逐滴加入0.1 moL/L的NaOH溶液10 mL，研磨使其完全溶解，然后加入到容量瓶中用去离子水定容至100 mL，经滤纸过滤后4℃保存，备用。

40万U/mL青霉素溶液：向400万U的青霉素粉末中加10 mL去离子水，混匀后4℃保存，备用。

1.4 培养基的制备

牛支原体培养基的配制：PPLO Broth 21 g/L，Yeast Extract 5 g/L，丙酮酸钠1 g/L，dd H2O 880 mL，116℃高压灭菌18 min，冷却至50～60℃，加入10X MEM 10 mL，40万U/mL青霉素2 mL/L，0.4%酚红溶液4.5 mL/L，4℃保存，备用。血清量的添加参照郭澍强［15］的研究结果，按照5%、10%、15%的血清浓度依次制备了9种液体培养基，具体见表1。在此基础上，用4个厂家生产的琼脂依次制备了4种固体培养基，分别编号为10（BD公司）、11（香港某公司）、12（上海某公司）和13（成都某公司）。

1.5 OD值测定法

将复苏的牛支原体菌液按1∶10比例分别接种于液体培养基1～9，每种培养基设3个重复，置37℃5% CO2恒温箱中培养，每隔12 h分别从各培养基中取样，在630 nm波长下测定其OD值，最后分别各取平均值作为培养基OD值［13］。

1.6 固体培养基评价指标

取复苏后牛支原体菌液50μL，分别接种于4种固体培养基（10、11、12、13），每种培养基设3个重复，置37℃5% CO2恒温培养箱中培养3～5 d，以其固体培养基的外观、菌落生长情况、菌落形态特征作为培养基的性能评价指标［16］，具体情况见表2。

1.7 数据统计分析

应用SPSS 21.0软件对OD值检测数据进行显著性分析，若P＞0.05，则差异不显著；若P＜0.05，则差异显著；若P＜0.01，则差异极显著。

表2 固体培养基性能指标评价数值

2 结果与分析

2.1 血清类型和浓度对牛支原体生长的影响

接种了牛支原体的9种液体培养基，置37℃5% CO2恒温箱中培养，每隔12 h取菌液，进行OD值测定，测定结果见表3、表4、表5、表6、表7、表8。结果表明：牛支原体在9种液体培养基中均在培养至60 h时其OD值达到最大；在添加相同血清浓度的情况下，经显著性分析显示，培养基1与4、7相比差异显著（P＜0.05），培养基4与7相比差异不显著（P＞0.05）；培养基2与5、8相比差异显著（P＜0.05），培养基5与8相比差异不显著（P＞0.05）；培养基3与6、9相比差异显著（P＜0.05），培养基6与9相比差异不显著（P＞0.05）。该检测结果说明牛支原体在添加了马血清的培养基中生长状态优于添加了猪血清和胎牛血清的培养基。

在添加相同类型血清的情况下，培养基2、3与1相比差异显著（P＜0.05），而培养基2与3相比差异不显著（P＞0.05）；培养基4、5、6之间相比差异不显著（P＞0.05）；培养基7、8、9之间相比差异不显著（P＞0.05）。该检测结果说明血清浓度对牛支原体生长造成的影响不大，基于培养基成本考虑选择添加10%血清的培养基作为今后培养牛支原体的使用量。

表3 添加5%血清的培养基在不同时间点的OD值检测结果

表4 添加10%血清的的培养基在不同时间点的OD值检测结果

表5 添加15%血清的的培养基在不同时间点的OD值检测结果

表6 添加了马血清的培养基在不同时间点的OD值检测结果

表7 添加了猪血清的培养基在不同时间点的OD值检测结果

表8 添加了胎牛血清的培养基在不同时间点的OD值检测结果

2.2 不同厂商琼脂对牛支原体生长影响

接种了牛支原体菌液的4种固体培养基培养3～5 d，肉眼观测培养基外观及菌落生长状况，并在低倍镜下观察菌落形态，性能指标评价结果见表9。结果表明，培养基10外观良好，表面平整，无裂缝；牛支原体生长良好、菌落数目多，呈均匀一致；低倍镜观察菌落形态呈典型的“油煎蛋样”；培养基性能指标得分为9分。培养基11外观正常，表面凹凸不平；培养基上有牛支原体生长，但菌落数目较少，分布不均匀；低倍镜下菌落形态不典型；培养基性能指标得分为7分。培养基12外观较差，表面凹凸不平；培养基上有牛支原体生长，但菌落数目少，分布不均匀；低倍镜下菌落形态不典型；培养基性能指标得分为5分；培养基13外观正常，但表面有裂缝；培养基上有牛支原体生长、但菌落数目稀少，分布一般；低倍镜下菌落形态不典型；培养基性能指标得分为6分。以上结果说明，由BD公司生产的琼脂所制备的培养基性能指标最优。

表9 4种固体培养基性能指标评分结果

3 小结与讨论

本试验选用3种类型的血清，按照5%、10%、15%的血清浓度依次制备了9种液体培养基，采用OD值检测法对牛支原体生长情况进行研究，结果表明，牛支原体在添加了马血清的培养基中生长状态优于添加了猪血清和胎牛血清的培养基。且10%与15%血清浓度对牛支原体生长造成的影响不大，基于培养基成本考虑选择添加10%血清的培养基作为今后牛培养支原体的使用量。在此基础上，用4个厂商琼脂依次制备了4种固体培养基，分别进行了牛支原体生长试验。结果表明，添加BD公司的琼脂所制备的固体培养基最适宜牛支原体的生长。

牛支原体病在全世界范围内流行，患病牛和带菌牛是该病的主要传染源，牛群一旦感染很难彻底清除，牛的发病率为50%～100%，病死率可达10%～50%，给养牛业带来巨大的经济损失［17］。在临床治疗过程中，药物的治疗效果不佳，因此，疫苗对该病的防控起到关键的作用，而选出生长快、滴度高的培养基是疫苗生产过程中的关键环节，目前所使用的培养基存在培养时间长、成本高和效率低，不适用于牛支原体的大量培养［18］。为此探索高效率的培养基为牛支原体的大量培养提供参考，并开发有效疫苗防控牛支原体病，保障养牛业的健康、快速发展。

对牛支原体分离培养时要求较高，不仅要无菌采集病变的组织样本，且在对样本的处理及培养全过程都要求严格无菌操作，增加了分离难度。牛支原体的基因组很小，只有典型细菌基因组的20%～40%，合成物质的能力和携带的信息量有限，因此，需要通过宿主细胞获取生长所需的营养物质，且体外培养时对培养基的营养物质成分要求很高，培养条件也很苛刻［19］。培养基中需加入血清、酵母粉、MEM等营养物质，并在37℃5% CO2环境中恒温培养3～5 d［20］，在液体培养基中呈现澄清透明无沉淀或少许沉淀的黄色，固体培养基中的菌落在低倍镜下可观察到典型的“煎蛋状”或“脐状”的菌落形态［21］。培养基中还需加入抗生素，以达到抑菌作用［22］。目前所用的培养基虽然能够提供胆固醇、氨基酸和维生素等营养物质，但存在培养时间长、效率低等弊端，因此需要改良出培养成本低、效率高的培养基，不仅用于牛支原体的大量培养，且对今后疫苗的研发有着重要的意义。本次试验选用3种动物的血清，按照5%、10%、15%的血清浓度依次制备了9种液体培养基，采用OD值检测法比较牛支原体在9种液体培养基中的生长情况，结果表明，牛支原体在9种液体培养基中均可生长，在培养至60 h时其OD值达到最大。在添加血清浓度相同的情况下，添加马血清培养基的OD值与添加猪血清或胎牛血清培养基的OD值相比差异显著，说明牛支原体在添加了马血清的培养基中生长状态优于添加了猪血清和胎牛血清的培养基。在添加相同类型血清的情况下，添加猪血清或胎牛血清的各培养基之间的OD值相比差异不显著，而添加马血清的各培养基之间的OD值相比，添加量10%和15%与5%相比差异显著，而10%与15%相比差异不显著，说明血清浓度对牛支原体生长造成的影响不大，基于培养基成本考虑选择添加10%血清的培养基作为今后培养牛支原体的使用量。

琼脂虽然无营养成分只是作为培养基的凝固剂和载体，但是培养基的凝胶强度过高，会造成菌落生长偏小，而培养基凝胶强度过低时，会影响培养基的外观，造成培养基表面不平整、不均匀有裂缝［23］。另一方面，不同厂商生产琼脂采用的原料也不相同，目前市场上主要使用的是石花菜和江蓠，由2种原料生产出的琼脂粉凝固点有很大的差异，并且不同厂商或同一厂商不同批号生产的琼脂其凝固强度也存在很大差异，将会对培养基的性能影响很大，从而影响微生物的生长和形态特征［24］。本次试验在血清添加种类和浓度的基础之上，选用4种厂商生产的琼脂制备固体培养基，接种一定浓度的牛支原体放入37℃、5% CO2恒温培养箱培养，通过比较4种固体培养基的外观、牛支原体生长情况和菌落形态，结果表明，由BD公司生产的琼脂制备的固体培养基的性能指标最好，不仅固体培养基外观良好，而且牛支原体生长良好、菌落形态典型，适宜牛支原体固体培养基的制备。