巴桑德吉 次尼 旦增央金 边巴顿珠 色珍

（西藏自治区藏医院开发应用研究所，西藏 拉萨 850000）

乌头属植物大部分为毛茛科植物，其药材多含乌头类生物碱类成分，主要为乌头碱、次乌头碱和新乌头碱等，上述这些成分即是它的有效成分又是毒性成分。川乌和草乌为毛茛科乌头属植物，收载于中国药典，其总生物碱（乌头碱、次乌头碱、新乌头碱）的限量标准为0.05%～0.15%，文献报道人口服乌头碱3mg～5mg 可致死。毛茛科乌头属较常用的藏药材，有铁棒棰、美丽乌头、和船盔乌头，其中铁棒棰（榜那）《卫生部药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准·藏药第一册》记载有大毒，使用须注意，而现代研究也表明其含双酯型生物碱，如乌头碱及次乌头碱，而其他两个品种是否含毒性成分在藏医界存在一定疑问。[1-4]因此文章通过现代检测方法对美丽乌头和船盔乌头药材进行乌头碱类双酯型生物碱含量测定，检测是否含上述乌头类生物碱及其量是否达到中毒剂量，从而为临床安全用药，以及各藏药厂购买原材料提供可靠依据。

美丽乌头为毛茛科植物美丽乌头Aconitum pulchellum Hand.-Mazz.的根，生于海拔2200m～4500m的水沟边、河滩、草甸或林间，分布于西藏拉萨、日喀则、山南、林芝等地。其功能主治为清热解毒，主治食肉中毒，药物中毒等各种中毒症，虚热劳损引起的热症，胆热、喉病。[5]

船盔乌头为毛茛科植物唐古特乌头Axonitum tanguticum(Maxim)Stapf 和船盔乌头Aconitum naviculare(Bruhl)Stapf 的干燥全草。夏末秋初花期连根采挖，除去杂质，阴干。其功能主治为清热解毒，生机收口，燥湿。用于传染病引起的发热，肝胆热病，血症，胃热，疡疮，蛇蝎咬伤以及黄水病。[1]

1 仪器

Aglien1260 高效液相色谱仪；Auto science AS20500 BDT Ultrasonic Cleaner；四川优普超纯水机；旋转蒸发器RE-6000A（上海亚荣生化仪器厂）；SHZ-Ⅲ型循环水真空泵（上海亚荣生化仪器厂）；药典筛（浙江上虞市道墟张兴纱筛厂）；万分之一电子天平（北京赛多利斯有限公司）；十万分之一电子分析天平；中草药粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；溶剂过滤器（津腾）。

2 试药

水为超纯水，甲醇、乙酸铵、冰乙酸、异丙醇、三氯甲烷、乙酸乙酯、氨水、乙腈、四氢呋喃等均为色谱纯；对照品：批号110799-201608 新乌头碱、批号110799-201610 乌头碱、批号110799-201609 次乌头碱，上述对照品均购于中国食品药品检定研究所；4 批样品分别购置日喀则、林芝、山南、门孜康藏医院，均经西藏自治区藏医院次仁巴珠专家鉴定。

3 方法学考察及结果

3.1 色谱条件

色谱柱:岛津C18柱(250mm×4.6μm，5μm);流动相:以乙腈-四氢呋喃(25:15)为流动相A,以0.1mol·L-1醋酸铵溶液(每l00mL 加二冰乙酸0.5mL)为流动相B，梯度洗脱条件见表1；柱温:35℃,流速:1.0mL·min-1，进样量10μL，检测波长:235nm；理论塔板数按照乌头碱峰计算不低于2000。

表1 梯度程序洗脱

3.2 溶剂的配置

3.2.1 混合对照品溶液制备。适量取乌头碱、次乌头碱、新乌头碱对照品，准确称定，加异丙醇和三氯甲烷等比例混合物，分别制成含新乌头碱0.2188mg/mL、次乌头碱0.22286mg/mL、乌头碱0.126mg/mL 的混合溶液，既得。

3.2.2 空白溶液的制备。异丙醇-三氯甲烷（1：1）混合溶液3ml溶解。

3.2.3 样品溶液的制备。分别取过药典筛三号的美丽乌头和船盔乌头粉末约2g，准确称定，放到加盖的锥形瓶中，然后倒入氨试液3mL，再倒入异丙醇和乙酸乙酯等比例混合溶液50mL，准确称定重量，超声（功率250W，频率35kHz；常温）30min，取出常温放冷，称定重量，摇匀，滤过。取续滤液25mL，40 度以下减压回收溶液至干，残渣准确加入异丙醇和三氯甲烷等比例混合溶液3mL溶解，滤过，续滤液作为样品溶液。

3.2.4 样品中加入混合对照品溶液的制备。分别取过药典三号筛的美丽乌头、船盔乌头药材粉约2g，准确称定，于每份中精密加入3.2.1 制备的混合对照品溶液0.5ml，按3.2.4制备方法制备样品加混合对照品溶液。

3.3 线性关系的考察

精密量取对照品混标溶液1mL、2mL、4mL、6mL、8mL、10mL，分别置于10mL量瓶中，加三氯甲烷-异丙醇（1:1）溶解并稀释至刻度，摇匀，即得个6 不同浓度的混标对照品溶液，分别取10μL 注入高效液相色谱仪，绘制标准曲线，分别得到回归方程：新乌头碱y1=11717.05X+5.02469,r=0.99964(n=7)；次 乌 头 碱y2=11794.11X+1.08746,r=0.99986(n=7)；乌 头 碱 y3=11362.17X-0.492851，r=0.99969(n=7)。表明新乌头碱在0.104～2.152ug、次乌头碱在0.104～2.152ug、乌头碱在0.005～1.26ug范围内线性关系良好。结果见图1。

图1 液相色谱及标准曲线图

3.4 精密度试验

精密吸取对照品混合溶液10ul，注入高效液相色谱仪，重复进样6 次，RSD%分别为：新乌头碱RSD=1.84 % (n=6)、次乌头碱RSD=3.15%(n=6)、乌头碱RSD=1.83(n=6)，表明仪器精密度较好。

3.5 检测限与定量限考察

最低检测限分别为乌头碱0.0030ug/ul、新乌头碱0.0073ug/ul、次乌头碱0.0015ug/ul。

定量限分别为乌头碱0.0089 ug/ul、新乌头0.023 ug/ul，次乌头碱0.0082ug/ul。

3.6 样品中含量的检测

分别精密吸取3.2.1、3.2.2、3.2.3、3.2.4制备的溶液10μL，注入高效液相色谱仪，计算和检测美丽乌头、船盔乌头药材中新乌头碱、次乌头碱和乌头碱的含量。结果空白溶液无干扰，样品溶液中未检测到上述化学成分，样品中加入混合对照品溶液的回收率均在95%以上，说明如果样品中有上述的乌头类生物碱，该条件能提取和检测出，并且提取方法对上述生物碱无损失。结果见色谱图2、图3和表1。

表2 四批榜那药材中次乌头碱的含量测定结果

图2 空白、混标、美丽乌头样品、美丽乌头加标溶液色谱图谱

图3 空白、混标、船盔乌头、船盔乌头加标溶液色谱图谱

3.7 结果及讨论

美丽乌头和船盔乌头药材为毛茛科乌头属植物，而中药“川乌”也是毛茛科乌头属植物，其乌头类双酯型生物碱即是它的有效成分也是其毒性成分，中国药典规定其乌头类总生物碱的限量为0.05%～0.15%，按照科属相同，成分相似的观点，对美丽乌头和船盔乌头进行了乌头类双酯型生物碱的测定，结果上述两个药材的供试品溶液中未检测到乌头类双酯型生物碱。供试品制备时加入新乌头碱、次乌头碱和乌头碱峰混标溶液，其回收率均在95%以上，说明如果美丽乌头和船盔乌头中有乌头类双酯型生物碱，该制备方法和色谱条件能检测出，并且制备过程对上述乌头类双酯型生物碱无损失。船盔乌头药材的标准收录于《卫生部药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准·藏药》第一册中，其功能主治为清热解毒，生机收口，燥湿；美丽乌头标准未收载，传统文献记载其功能主治为清热解毒，主治食肉中毒、药物中毒等各种中毒症，虚热劳损引起的热症、胆热、喉病。现代文献报道船盔乌头药材主要成分为异叶乌头碱、大麦芽碱、塔拉乌头胺，未报道其含乌头类双酯型生物碱乌；美丽乌头药材所含化学成分报道极少，仅有一篇报道其含有异叶乌头碱［1-4］。结合上述的文献及试验初步证明美丽乌头和船盔乌头中不含毒性较大的乌头类双酯型生物碱，为临床安全用药提供保证。