彭 婕，李弼民，雷宇鹏

还原型辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶家族(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，NOX)是一类产活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的功能酶，肝组织ROS主要来源于NOX4[1-3]。在肝纤维化的发生发展过程中，ROS可介导HSC活化和多种促纤维化因子的激活[4,5]。研究显示， NOX1和NOX4的共同抑制剂GKT137831可减轻肝纤维化大鼠体内ROS生成量和肝纤维化程度，提示NOX4可能参与了肝纤维化的发生发展过程[6]。本研究观察了不同肝组织NOX4水平情况，同时利用siRNA技术构建了低表达NOX4的HSC-T6细胞，探讨了NOX4对HSC-T6细胞增殖、凋亡和纤维化相关通路的影响。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂 SPF级雄性C57BL/6J小鼠，6～8周龄，体质量为18～22 g，购自上海邦耀生物科技有限公司【动物许可证号为SCXK(沪)2019-0050】。鼠系肝星状细胞HSC-T6细胞购自美国ATCC。CCl4(天津泰泽兴业生物)，脂质体2000试剂盒(美国Invitrogen)，基因序列和siRNA干扰序列(上海美轩生物)，抗NOX4、抗α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)、抗I 型胶原(collagen I，Col1a I)、抗组织金属蛋白酶抑制剂1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1)、抗金属蛋白酶2(metalloproteinase -2，MMP-2)、抗转化生长因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、抗Smad2、抗p-Smad2、抗Smad3和抗p-Smad3蛋白(美国Cell Signaling)，DCFH-DA荧光探针和MTT粉末(上海恒斐生物)，Annexin V-FIFC/PI试剂盒(上海泽叶生物)。

1.2 肝纤维化动物模型的制备 将小鼠随机分为对照组10只和模型组10只，分别给予等体积橄榄油或10% CCl4(CCl4:橄榄油体积比=1∶9)腹腔注射， 2次/w，注射6 w，构建肝纤维化模型。在最后一次注射24 h后，处死动物，迅速取出小鼠肝脏，部分固定于甲醛溶液中，制成组织切片，经脱蜡、切片，常规行HE染色和Masson染色，光镜下观察。将剩余的肝组织冻存于液氮罐中。

1.3 细胞培养、分组与转染 正常培养HSC-T6细胞，待细胞生长至对数生长期时，消化细胞、传代。取生长状态良好的细胞，接种于6孔板，分为对照组、无意义对照组和NOX4-siRNA干预组。在后两组，分别转染无意义序列或NOX4-siRNA，构建低表达NOX4的细胞株。

1.4 肝组织和细胞NOX4 mRNA水平检测 用Trizol试剂提取组织和细胞总RNA，再逆转录合成cDNA模板，采用qRT-PCR法检测NOX4 mRNA水平。NOX4上游引物序列为：CAGGAGG GCTG CTGAAGTATCAA，下游引物序列为：TGACTGGCTTATTGCTCCGGATA；内参GADPH上游引物序列为：ATGTTCCAGTATGACTCCACTCACG，下游引物序列为：GAAGACACCAGTAGACTCCACGACA[7]。反应参数为94℃预变性5 min、94℃变性60 s、68℃退火60 s、72℃延伸60 s，共30个循环。以GADPH为内参，采用2-△△CT法计算样品NOX4 mRNA相对水平。

1.5 肝组织和细胞NOX4 表达检测 采用Western blot法检测，采用RIPA法提取组织和细胞蛋白，检测蛋白浓度后，取蛋白50～100 μg，行凝胶电泳分离，待标记物移动至底部前终止电泳。将凝胶切成适宜大小、转膜，再行免疫反应，最后进行ECL显影。采集蛋白条带图片，应用Image J软件行灰度分析，以β-actin为内参，计算NOX4、α-SMA、Col1a I、TIMP-1、MMP-2、TGF-β1、Smad2、p-Smad2、Smad3和p-Smad3相对表达量。

1.6 细胞ROS含量检测 将各组细胞接种于6孔板，培养24 h，用无糖培养基饥饿细胞12 h，加入DCFH-DA荧光探针，继续孵育30 min，于荧光酶标仪检测细胞荧光量。

1.7 细胞增殖检测 采用MTT法，取各组细胞1×105/mL，接种于96孔板，培养24 h、48 h、72 h，分别加入含10%MTT的PBS缓冲液，继续孵育4 h，再加入DMSO 150 μL，于570 nm处检测各孔吸光度值(OD值)。

1.8 细胞周期和凋亡检测 制备细胞悬液，经预冷的PBS清洗后，在70%乙醇中固定1 h，加入PI染液重悬细胞，上流式细胞仪(美国BD)检测细胞周期的变化；加入Annexin V避光下孵育细胞15 min，上流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

2 结果

2.1 两组小鼠肝组织NOX4 mRNA水平比较 与对照组比，模型组小鼠肝组织NOX4 mRNA和蛋白水平均显著上升(P<0.05，图1)。

图1 两组小鼠肝组织NOX4水平变化

2.2 三组HSC-T6细胞NOX4和ROS水平比较 NOX4-siRNA处理组NOX4 mRNA及其蛋白和ROS水平显著低于对照组(P<0.05)，但对照组与无意对照组NOX4 mRNA及其蛋白和ROS水平比较，差异无统计学意义(P>0.05，图2)。

图2 三组HSC-T6细胞NOX4和ROS水平比较

2.3 三组HSC-T6细胞增殖能力比较 NOX4-siRNA干预组细胞增殖活性和S期细胞比例显著低于对照组，而G0/G1期细胞比例显著高于对照组(P<0.05)；对照组与无意组细胞增殖活性和各周期细胞比例比较，差异无统计学意义(P>0.05，图3)。

图3 三组HSC-T6细胞增殖能力比较

2.4 三组HSC-T6细胞凋亡水平比较 NOX4-siRNA处理组细胞凋亡率显著高于对照组(P<0.05)，但对照组与无意组细胞凋亡率比较，差异无统计学意义(P>0.05，图4)。

图4 三组HSC-T6细胞凋亡水平比较

2.5 三组HSC-T6细胞纤维化相关蛋白表达量比较 NOX4-siRNA处理组α-SMA、Col1a I、TIMP-1、MMP-2、TGF-β1、p-Smad2/Smad2、p-Smad3/Smad3表达水平显著低于对照组(P<0.05)，而对照组与无意组上述蛋白表达量比较，差异无统计学意义(P>0.05，图5)。

图5 三组HSC-T6细胞纤维化相关分子表达水平比较

3 讨论

在肝细胞受到损伤刺激时，NOX能诱导ROS促进HSC的活化，从而导致肝损伤及肝纤维化。同时，ROS水平上升也提高了机体氧化应激水平，进一步损伤肝细胞结构和功能[8]。另外，大量数据显示，NOX4生成的ROS能间接损伤蛋白质、DNA、类脂等物质，从而调节细胞增殖和凋亡[9,10]。研究指出， HSC胞内NOX4呈高水平，且高于NOX家族其他酶类，提示NOX4可能具有特异性功能，参与HSC的激活过程[11]。因此，有人推测NOX4在肝纤维化发生发展过程有重要的作用，可能作为控制肝纤维化的新靶点。

本研究组织病理学观察结果显示，模型小鼠肝组织出现明显的病理学损伤，且沉积有大量胶原纤维，符合肝纤维化的病理学特征，提示肝纤维化模型制备成功。同时，肝组织NOX4水平的检测结果显示，肝纤维化组织NOX4 mRNA及其蛋白水平均升高，提示NOX4在肝纤维化发生发展进程中有重要的作用，与有关研究[12]结果相符。

近年来研究发现，肝硬化是可以逆转的，而HSC的凋亡在逆转过程中有重要作用[13]。在正常生理状况下，HSC为静止状态。当受到外界因素刺激后会激活HSC，生成大量的纤维组织成分，增加细胞外基质。在肝纤维化恢复阶段，HSC活化水平下降，且大量凋亡[14,15]。本研究结果显示，沉默HSC-T6细胞NOX4表达，HSC-T6细胞的增殖受到明显的抑制，大量细胞停滞于G0/G1期，且细胞凋亡率明显增加，提示下调NOX4能抑制HSC-T6细胞增殖，促进其凋亡，从而抑制肝纤维化发展。所以，可以反推因为NOX活化，合成大量的ROS，能促进HSCs的异常增殖，从而产生大量的胶原物质并沉积，促进肝纤维化的形成。

此外，在肝纤维化过程中有多种细胞、蛋白及其细胞因子的参与。α-SMA、Col1a I和TIMP-1是重要的促纤维化因子[16,17]。本研究显示，下调NOX4的HSC-T6细胞α-SMA、Col1a I和TIMP-1水平显著降低，提示NOX4可能调控上述促纤维化因子的生成，从而参与肝纤维化的发生发展。研究证实，TGF-β /Smad通路在肝纤维化形成过程中有重要的调控作用，TGF-β1与细胞膜受体结合后活化，诱导Smad3等因子进入细胞核进行基因调控。本研究发现，下调NOX4的HSC-T6细胞TGF-β1、Smad2 和Smad3 磷酸化水平显著下降，表明HSC-T6细胞NOX4可以激活TGF-β /Smad信号通路，可能是NOX4参与肝纤维化的发生机制之一。