王丽惠，张佳祥，刘双平，张惠勇，卢秋燕，沈培根

我国是肝病发生率较高的国家，肝病是全球范围内引起死亡的重要原因之一[1]。肝损伤是肝病的主要表现，而引起肝损伤的因素也较多，免疫性肝损伤主要是外界异物进入体内，引起免疫细胞介导的免疫反应，导致肝组织大量炎性细胞浸润，从而引起肝损伤[2，3]。原儿茶酸是一种天然的芬酸类物质，广泛存在于蔬菜和水果中，也是很多中草药的主要药效成分[4]。研究表明，原儿茶酸除了具有抗血小板凝聚、降低心肌耗氧量等药理作用外[5]，还具有很好的体外抗氧化活性，能够抑制H2O2诱导的PC12细胞凋亡和1-甲基-4-苯基吡啶(MPP+)诱导的PC12细胞损伤[6，7]，表明其对神经损伤具有一定的保护作用，但尚未有原儿茶酸对免疫性肝损伤具有保护作用的相关研究报道。本研究采用刀豆蛋白A(concanavalin A，ConA)诱导小鼠免疫性肝损伤模型，探讨了原儿茶酸抗肝损伤作用及其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂与仪器 SPF级雄性昆明小鼠60只，体质量为19.37±1.24 g，购自湖北省实验动物研究中心[生产许可证号：SCXK(鄂)2015-0018]，饲养在武汉大学中南医院动物实验中心[SYXK(鄂)2015-0025]。原儿茶酸(中国药品生物制品鉴定所，批号：20140812)；刀豆球蛋白A(美国Sigma公司，批号：201608)；检测白介素-4(IL-4)、IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；UV 1100紫外分光光度计(上海天美科学有限公司)；VARIOSKAN FLASH 2.4.3型全波长多功能读数仪(美国Thermo公司)。

1.2 免疫性肝损伤模型的制备 随机将60只小鼠分为对照组、模型组、小、中、大(2.5 mg·kg-1·d-1、5 mg·kg-1·d-1、10 mg·kg-1·d-1)原儿茶酸和(0.2 g·kg-1·d-1)联苯双酯处理组，在对照组和模型组给予等量生理盐水灌胃处理，在药物处理组分别给予不同剂量的药物灌胃，连续10 d。在末次给药1 h后，经尾静脉注射ConA 35 mg.kg-1，诱导免疫性肝损伤小鼠模型。在造模8 h后，称量体质量，摘眼球取血，采用脱颈法处死动物，剖取肝脏和脾脏，称量并计算肝、脾脏质量指数(分别=肝、脾脏质量/体质量×100%)；对抽取的血液经3000 r/m离心10 min，分离血清，保存于-20℃待测；剪取小部分肝组织，于冰上研磨成肝组织匀浆，离心后取上清，保存于-20℃待测；另取部分肝组织，用10%甲醛固定，制成组织切片，显微镜下观察。

2 结果

2.1 各组小鼠脏器指数比较 与正常组小鼠比，模型组小鼠肝和脾脏指数均显著升高，不同剂量原儿茶酸和联苯双酯处理后，肝、脾脏指数均显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05，表1)。

表1 各组小鼠脏器指数比较

2.2 各组小鼠血生化水平比较 与正常组小鼠比，模型组小鼠血清ALT和AST水平均显著升高，不同剂量原儿茶酸和联苯双酯处理后，血清ALT和AST水平均显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05，表2)。

表2 各组小鼠血生化指标比较

2.3 各组小鼠血清炎性细胞因子水平比较 与正常组小鼠比，模型组小鼠血清IL-4、IL-6和TNF-α水平均显著升高，不同剂量原儿茶酸和联苯双酯处理后，血清IL-4、IL-6和TNF-α水平均显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05，表3)。

表3 各组小鼠血清细胞因子水平比较

2.4 各组小鼠肝组织匀浆MDA、NO、SOD和GSH-PX水平比较 与正常组小鼠比，模型组小鼠肝组织匀浆MDA和NO水平显著升高，而SOD和GSH-PX活性显著降低，不同剂量原儿茶酸和联苯双酯处理后，MDA和NO水平显著降低，SOD和GSH-PX活性显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05，表4)。

表4 各组小鼠肝组织匀浆MDA、NO、SOD和GSH-PX水平比较

2.5各组小鼠肝组织病理学表现 正常组小鼠肝小叶结构清晰，未见明显损伤；模型组小鼠可见肝细胞肿胀，并伴有大量的炎细胞浸润；不同剂量原儿茶酸和联苯双酯处理后，肝细胞肿胀程度显著减轻，炎性细胞浸润程度也明显减少(图1)。

图1 各组小鼠肝组织病理学表现(HE，400×)

3 讨论

ConA诱导的肝损伤模型是目前筛选肝病治疗的理想模型之一，其具有较好的肝脏特异性，并且造模过程简单快速，能够在一定程度上模拟人类病毒性肝病和自身免疫性肝病的病理学变化过程[8，9]。用不同剂量的ConA处理小鼠能引起肝损伤，并以坏死为主，并且模型较稳定[10]。因此，本研究选择ConA建模[11]。本研究结果显示，经ConA处理后，小鼠血清ALT和AST显著升高，而经不同剂量的原儿茶酸处理后，血清上述指标水平显著降低，表明原儿茶酸具有一定的肝损伤保护功能。

目前研究显示，ConA导致的免疫性肝损伤模型均伴有各种免疫反应，而这些免疫反应有多种免疫细胞和炎症因子的介导[12]。TNF-α是由单核巨噬细胞产生的具有重要生物活性的细胞抑制剂，在机体免疫反应、炎症反应、组织重构、细胞增殖和凋亡过程中均发挥着重要的作用[13]。有研究显示，ConA诱导的免疫性肝损伤过程伴有TNF-α表达水平升高[14]。IL-4和IL-6均是免疫调节因子和炎症介质，IL-4主要由活化的T细胞合成，能够促进T细胞和B淋巴细胞分化并能激活Th2细胞为主的免疫应答[15]，而IL-6主要通过刺激细胞生长和胞外基质的增生，是引起肝脏炎症的重要因素[16]。本研究结果显示，模型组小鼠血清TNF-α、IL-4和IL-6水平均显著升高，而不同剂量的原儿茶酸处理后，小鼠血清这些细胞因子水平显著降低，表明原儿茶酸可能通过抑制炎症细胞因子的合成和分泌，进而保护肝脏。

人体在生理和病理过程中均有氧自由基的形成，后者在机体正常的生化反应过程中充当着重要的中间体，但过量的氧自由基会引起组织的损伤和破坏，因此机体有一套完整的抗氧化酶防御自由基损伤系统[17]。SOD作为其中重要的一种内涵性金属酶，能够将超氧自由基歧化为过氧化氢，在GSH-PX的作用下继续转化为水，进而清除过量的氧自由基，而在免疫性肝损伤过程中，氧自由基大量生成，而SOD和GSH-PX等活性受到抑制，未被清除的氧自由基会攻击细胞膜脂质，形成脂质过氧化的链式反应，MDA作为该过程的终产物，能够间接反映机体受自由基攻击的程度[18]。NO则作为一种活性介质，在肝损伤过程中发挥着双重作用，既发挥着维持正常生理功能的作用，又参与病理性损伤过程[19]。本研究结果显示，在ConA处理小鼠，肝组织匀浆MDA和NO水平显著升高，而SOD和GSH-PX活性显著降低，表明肝组织发挥了脂质过氧化反应，而MDA能够严重地损伤肝细胞膜结构，引起细胞肿胀、坏死。经过不同剂量的原儿茶酸处理后，组织MDA和NO水平显著降低，而SOD和GSH-PX活性显著升高，可能是因为原儿茶酸本身就是一种抗氧化剂，能够有效中和体内过量的氧自由基，解除对SOD和GSH-PX活性的抑制作用，从而减少对肝细胞脂膜的攻击，进而保护了肝组织[20]。