刘晓娟，宋艳玲，刘海洋，孙福佳

（1.阜新市产业技术创新推广中心，辽宁阜新 123000；2.沈阳化工大学制药工程教研室，辽宁沈阳 110142；3.阜新市交通运输综合行政执法队，辽宁阜新 123000）

齐墩果酸具有广泛的生物活性，包括肝脏保护、抗菌消炎、抗肿瘤、抗HIV和降血糖[1]等药理作用。经查阅文献，本实验设计将OA的C-3位羟基氧化保护，28位引入乙二胺片段，降低28反应位点的空间位阻，同时引入取代苯环作为疏水性基团，设计1个新型化合物使OA更容易进入细胞并提高抗肿瘤活性，并通过计算机辅助设计，MVD软件与VEGFR靶点进行对接，用Discovery studio直观分析化合物与靶点的结合情况Mol Dock Score（OA）=-68.098 4，Mol Dock Score（化合物4）=-138.638，由于 68.098 4小于138.638，所以预估化合物4活性高于OA，因此合成化合物4并进行体外抗肿瘤活性测试，见图1。

图1 合成路线实验部分

1 实验设备与材料

数显微熔点测定仪，温度计未经校正；ARX-300/500MHz核磁共振谱仪（德国Bruker公司），CDCl3为溶剂，TMS为内标；Agilent1100SL型离子阱质谱仪测定仪（美国安捷伦公司）；

齐墩果酸（批号：CY160305，规格：500mg，陕西慈缘生物技术有限公司），实验所用试剂均为市售分析纯。显色剂为10%硫酸乙醇溶液和0.2g/100mL茚三酮乙醇溶液。

2 实验方法

2.1 制备3-羰基齐墩果酸

将OA（2.5g，5.47mmol）和200mL丙酮加入干燥的茄型瓶（500mL），搅拌，冰盐浴下待温度降至0℃以下，缓慢滴加约150滴Jones试剂，直到溶液橙色不再消失，让试剂在室温静置2h，加入80mL异丙醇进行淬灭反应30min。反应结束后，通过真空旋转蒸发掉部分溶剂，并对溶剂进行稀释，萃取乙酸乙酯，用饱和盐洗涤3次，用无水Na2SO4干燥过夜，经静止，抽滤，洗涤，减压旋蒸等程序最终得到化合物2白色晶体约1.89g，产率96%。

2.2 制备3-羰基齐墩果酸酰氯

将化合物2（3.50g，7.69mmol）和30mL无水二氯甲烷加入干燥的反应瓶（100mL）中并加热至40℃，缓慢滴加草酰氯（4.0mL，48.95mmol），回流2h，反应结束后，减压蒸干溶剂，加入两次环己烷，每次30mL，减压蒸干得浅棕色固体粉末，密闭备用。

2.3 制备3-羰基-28-N（乙基）-齐墩果酸甲酰胺

将羰基齐墩果酸酰氯（1.5g，3.17mmol）和30mL无水三氯甲烷添加到干燥的反应瓶（100mL）中，搅拌，完全溶解后缓慢滴加到乙二胺溶液中，加入DMAP（0.02g，0.17mmol）和无水吡啶（1.25mL，15.70mmol）。室温下静置2h，反应完成后用10mL浓度5%盐酸稀释后留取下层溶液，萃取二氯甲烷，饱和食盐水冲洗3次，无水Na2SO4干燥过夜，经静止，抽滤，洗涤，旋蒸等程序得到棕色粉末化合物3，50℃真空干燥过夜。以硅胶柱色谱分离，甲醇-二氯甲烷（1∶150）洗脱，得化合物3白色粉末1.37g（7.85mmol），产率80%。mp：149.5～150.3℃。ESI-MS m/z：497.4[M+H]＋。1H NMR（600MHz，CDCl3）δ/6.60（1H，d，J=5.1Hz，-CONH），5.40（1H，d，J=15.1Hz，H-12），3.51（1H，dd，J=13.7，5.8Hz，CONHCH2CH2），3.22（1H，dd，J=13.9，5.6Hz，CONHCH2CH2），3.07（2H，s，CONHCH2CH2），2.94（2H，t，J=5.4Hz，-NH2），2.63（1H，d，J=9.4Hz，H-18），2.55（1H，m，H-2），2.37（1H，m，H-12）。2.55（1H，ddd，J=15.9，11.1，7.3Hz，H-2），2.37（1H，ddd，J=15.7，6.5，3.5Hz，H-2）。1.17（3H，s，-CH3），1.09（3H，s，-CH3），1.05（6H，s，2CH3），0.92

（3H，s，-CH3），0.91（3H，s，-CH3），0.81（3H，s，-CH3）。

2.4 制备羰基-28-N（2-（甲氧基丁烯氧基苯甲酰胺基）乙基）-齐墩果酸甲酰胺

将肉桂酸（0.74g，5.02mmol），溶解于20mL无水三氯甲烷中，逐滴加入草酰氯（2.4mL，28.95mmol），保持恒温40℃3h。待反应结束后，加入两次环己烷，每次30mL，减压蒸干得浅棕色固体粉末，密闭备用。将化合物3（0.54g，1.0mmol）、10mL无水三氯甲烷加入干燥的50mL茄型瓶中，搅拌，充分溶解后，加入新制备的（0.83g，5mmol）肉桂酸酰氯，无水吡 啶（0.41mL，5.0mmol） 和 DMAP（0.006g，0.05mmol），升温至60℃，持续回流反应3h。结束后用20mL浓度5%稀释盐酸清洗后留取下层溶液，萃取二氯甲烷，并用食盐水冲洗3次，无水NaSO4干燥过夜，经静止、抽滤、洗涤、旋蒸等程序得到化合物5a白色粉末固体0.47g，产率75%。mp：138.8～140.1℃。ESI-MS m/z：627.5[M+H]＋。1H NMR（600MHz，CDCl3）δ/7.60（1H，d，J=15.7Hz，COCH=CH-），7.51-7.47（2H，m，ph-H-2’，H-6’），7.38 - 7.32（3H，m，），6.91（1H，d，J=17.7Hz，CONHCH2CH2NH），6.49（1H，t，J=11.5Hz，CONH），6.42（1H，d，J=15.7Hz，COCH=CH-），5.43（1H，t，J=3.4Hz，H-12），3.63-3.25（4H，m，-CONHCH2CH2），2.61（1H，d，J=15.4Hz，H-18），2.57 - 2.47（1H，m，H-2），2.34（ddd，J=15.8，6.6，3.6Hz，H-2），1.17，1.08，1.02，0.99，0.90，0.89，0.79（each 3H，s，-CH3）。

3 化合物的抗肿瘤活性测试

使用舒尼替尼作为阳性对照药物，通过MTT法测试目标化合物的抗肿瘤活性，并选择人肺癌细胞和人胃癌细胞作为测试目标。具体流程：取0.30%胰蛋白酶消化液单层培养的人肺癌细胞、人胃癌细胞以含10%胎牛血清的RPMI 1640为培养液稀释调整。人胃癌细胞、人肺癌细胞为2.1×104个/mL、2.4×104个/mL的单细胞溶液，将其培养于培养板内，以250μL/孔接种到培养板内。将孔培养板置40℃、CO2浓度为5%湿度保温箱中培养24h，分别加入浓度为500μg/mL，50μg/mL，5μg/mL，0.5μg/mL，0.05μg/mL的待测药物，阴性对照组与培养液中加入一定体积的溶剂，并建立空白对照组，继续在40℃和CO2浓度为5%保温箱中放置72h，每孔加入20μL MTT溶液，于40℃下继续静置4h，选取下层溶液，并向每孔加入100μL溶解甲臜颗粒，在振荡器上上下震荡使其溶解。测量每个孔的光密度，计算所测化合物对细胞的抑制率及IC50。为了使实验数据更具有说服力，再重复该实验2次取3次结果平均值作为最终数据。

按以下公式计算抑制率：

用IC50计算软件来计算半数抑制浓度（IC50）

表1 目标化合物对SGC7901细胞和A549细胞的活性抑制

化合物浓度为5μg/mL，经过48h处理后的细胞抑制率：所测化合物4对人胃癌细胞SGC7901的IC50是18.21μmol/L，活性显著高于母体OA，活性与已上市药物舒尼替尼相当。

4 结论

所测化合物4对人胃癌细胞SGC7901的IC50是18.21μmol/L。活性显著高于母体OA，构效关系分析：对SGC7901人胃癌细胞的IC50值4 小于OA，表明C-3改造成羰基，羰基与氨基酸残基形成氢键，同时C-28位羧基引入乙二胺片段，引进疏水性基团，氨基酸残基形成牢固氢键有关。证实了本实验中计算机分子模拟对接的准确性与实验设计的合理性。