毛梦菌，吴佳俊，高 倩

(衢州市衢江区畜牧兽医站，浙江 衢州 324022)

哺乳动物卵巢中含有大量的腔前卵泡，但是在发育到有腔卵泡前大约有99.9%的卵泡都走向闭锁、退化，这无疑是动物繁殖领域内巨大的浪费。卵母细胞是体外受精、胚胎移植、动物克隆和转基因等胚胎生物技术研究和开发不可或缺的材料，然而卵母细胞来源十分匮乏成为其发展的一个制约性因素，无疑腔前卵泡的体外培养技术为其提供了一个有效途径。褪黑素(MT)在生殖调控中具有重要作用，在人排卵前卵泡液中发现了高水平的褪黑素，提示褪黑素有可能直接参与卵泡的生殖调控。

1 材料与方法

1.1试验材料 猪卵巢从北京市郊区屠宰场采集，经灭菌生理盐水洗涤后，在装有37℃添有双抗的灭菌生理盐水的保温瓶中2 h内运回实验室。

1.2主要化学试剂 DMEM/F12粉末(GIBICO)，FBS(Sigma)，抗坏血酸(Ascorbic acid，Sigma)，ITS(Gibico)，青霉素钠(Penicillin G，Sigma)，链霉素(Streptomycin sulfate,Sigma)，促卵泡激素(FSH，Sigma)。

1.3主要仪器、耗材 恒温CO2培养箱(Thermo)，超净工作台(SW-CJ-IF)，体视显微镜(Olympus)，倒置显微镜(Olympus IX-50)，96孔培养板(Corning Incorporated，3599)，PCR仪，离心机以及万级净化实验室。

1.4试剂配制方法 DMEM/F12培养液的配制见表1。

表1 DMEM/F12的成分及配制方法

将上述成分分别加入500 mL灭菌Milli-Q超纯水中，充分溶解后，调节pH为7.2-7.4，定容至1000 mL。溶液配制好后，用0.22 μm滤膜过滤灭菌，并用250 mL高压灭菌玻璃瓶分装，4℃保存。

双抗(Penicillin Streptomycin)100×储备液：青霉素10,000 U/mL、链霉素10,000 μg/mL,分装于无菌EP管中，200 μL/管，-20 ℃冻存。

ITS(胰岛素转铁蛋白硒酸)100×储备液：各个成分浓度(g/L):胰岛素1.00，转铁蛋白0.55，亚硒酸钠0.00067，氨基乙醇0.20；原装10 mL/瓶，分装于无菌EP管中，200 μL/管，4 ℃避光保存。

FSH储备液：取1 mg FSH溶解于10 mL超纯水中，配成0.1 mg/mL母液，用0.22 μm微孔滤膜滤菌后分装到0.5 mL离心管中，-20 ℃保存。……