郭亚迪，孟祥宇，戴华鑫，陈千思，翟振，王爱国，梁太波*，尹启生

1.中国烟草总公司郑州烟草研究院，郑州高新技术产业开发区枫杨街2号450001

2.河南中烟工业有限责任公司黄金叶生产制造中心，郑州经济技术开发区第三大街9号450016

碳纳米材料（Nano-materials，NMs）可促进植物的生长发育，被广泛应用于农业和生命科学领域［1］，针对碳纳米材料促进植物生长发育的生理基础和分子机制已有研究［2］。碳纳米溶胶（Carbon-nano sol，NC）属于碳纳米材料的一种，利用脉冲式电极法电解石墨制备而成，具有生物相容性好［3］、易制备和成本低等［4］优点。研究表明，碳纳米材料能促进作物种子的萌发［5-6］、根系的伸长［7-8］和营养元素的积累［9］，调节植物的生长发育。碳纳米溶胶在提高作物肥料利用率、增强根系活力以及提升作物品质方面展现出巨大潜力［10-12］。钾是植物生长所必需的大量营养元素之一，在植物生长发育进程中起着重要作用。钾可以维持细胞的膨压，调节细胞渗透势及多种酶的活性［13-14］，还可以促进同化产物的输出，促进蛋白质、脂肪的合成，增强植物抗逆性［15］。钾还被称为烟草体内的“品质元素”，与烟叶的燃烧性和吸食品质密切相关，在提高烟叶内在品质方面起着重要作用［16-17］。研究发现，碳纳米溶胶能调控K+通道相关基因的表达，促进根系对钾素的吸收，提高烟叶钾素的积累量［18］，但目前有关碳纳米溶胶促进K+吸收、转运和积累的生理机制尚不清楚。

非损伤微测技术（Non-invasive Micro-test Technology，NMT）是研究和测定离子或分子流的一种先进科研手段，具有非损伤、时空分辨率高等优点，已被广泛应用于医药学、农业科学等领域［19］，但其在烟草根系对K+的吸收以及K+在烟草根系的流速、流向等研究中的应用鲜见报道。为此，以碳纳米溶胶和不同烟草品种为试验材料，利用NMT研究碳纳米溶胶对烟草根系K+流速和流向的影响，结合K+通道相关基因的表达量，探索K+的吸收、转运和积累机理，旨在为进一步揭示碳纳米溶胶促进烟草对钾素吸收的作用机制和纳米碳在农业生产中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试烟草品种分别为RG17、鄂烟1号（EY-1）、云烟87（Y87）和中烟100（Z100），种子由中国烟草遗传育种研究（北方）中心和河南省农业科学院烟草研究所提供。碳纳米溶胶（北京奈艾斯新材料科技有限公司）采用脉冲式电极法电解石墨制备，粒径10～100 nm。

1.2 烟苗培养

烟苗的培养在中国烟草总公司郑州烟草研究院温室中进行。烟草种子经消毒后播种于育苗盘，待生长50 d并达到6叶1心时，每个烟草品种选取生长一致的幼苗移栽至培养盒中进行砂培试验。砂培基质为石英砂，提前杀毒灭菌、烘干备用，营养液为1/2 Hoagland营养液。

1.3 试验设计

砂培条件下，设置对照（CK）和碳纳米溶胶处理（NC），对照使用1/2 Hoagland营养液进行培养，处理使用含碳纳米溶胶（浓度为10 mg/L）的1/2 Hoagland营养液，每个培养盘放置30个培养盒，每隔3～5 d向培养盘中添加1次营养液，每次用量为3 L，共添加4次，培养20 d。

1.4 测定项目及方法

1.4.1 钾素含量的测定

烟苗培养20 d后，每个品种选取3株生长一致的烟苗，将茎叶和根系分开，经蒸馏水洗净、滤纸吸干水分后，105℃杀青15 min，65℃烘干后称量。称样磨粉，采用HNO3-H2O2微波消解体系进行烟株样品消解［20］，火焰原子吸收分光光度法测定钾含量（质量分数）［21］。

1.4.2 根系K+流速的测定

烟苗培养20 d后，每个品种选取6株生长一致的烟苗，采用NMT100 Series非损伤微测系统（美国Younger USA LLC公司）进行根系K+流速测定，每株幼苗稳定测试300 s。测定K+流速前对测试植株进行3 d的钾饥饿处理［22］（饥饿液Ⅱ为磷酸铵和硝酸铵替代硝酸钾和磷酸二氢钾的1/2 Hoagland营养液）。测试液：0.1 mmol·L-1KNO3，0.1 mmol·L-1CaCl2，0.3 mmol·L-1MES，pH 6.0。校正液Ⅰ：0.05 mmol·L-1KNO3，0.1 mmol·L-1CaCl2，0.3 mmol·L-1MES，pH 6.0。校正液Ⅱ∶0.5 mmol·L-1KNO3，0.1 mmol·L-1CaCl2，0.3 mmol·L-1MES，pH 6.0。测定前将烟草根尖固定在塑料培养皿底部，加入测试液，放在倒置显微镜的载物台上，在视野中找到拟测定的根尖，然后调节K+电极至根部分生区表面（距根尖约450μm），以测定点间距为30μm进行两点测量，并计算流速。

1.4.3 K+通道基因表达量测定

烟苗培养20 d后，采集烟苗根系和叶片样品，用锡纸包裹并迅速置于液氮中冷冻，而后转入-80℃超低温冰箱保存。从-80℃冰箱取出待测样品，加液氮研磨后，使用TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit试剂盒（日本TaKaRa公司）进行总RNA的提取，具体操作参照试剂盒使用说明进行。使用Nanodrop 2000检测RNA样品的质量和浓度。按照QuantiTect Reverse Transcription Kit试剂盒（德国QIAGEN公司）操作步骤将总RNA反转录合成cDNA。

在NCBI中检索烟草相关基因序列，根据K+内流通道基因NKT1（AB196790）、NtKC1（AB196791），K+外流通道基因NTORK1（AB196792）的cDNA全长序列设计引物，以ACTIN（AB158612）为内参基因。其中，基因NtKC1、NTORK1和ACTIN的引 物序列参照Dai等［23］的 方法，基因NKT1的引物序列参照杨健等［18］的方法，引物序列见表1。使用LightCycler 480Ⅱ荧光定量PCR仪（德国Roche公司）进行荧光定量PCR反应。PCR反应体系为20μL：cDNA 2μL，引物F 1 μL，引物R 1μL，SYBR Green I（2×conc。）10μL，ddH2O 6μL。PCR反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性10 s，55℃退火15 s，72℃延伸15 s，45个循环，其中基因NKT1和NtKC1的退火温度为60℃。

1.4.4 数据处理

采用Microsoft office Excel 2019软件进行数据汇总及整理，利用SPASS 19.0软件对数据进行描述性统计及方差分析，使用GraphPad Prism 8.0作图。各基因表达量通过LightCycler 480 software release 1.5.0 SP3软件分析得到Cp值（每个反应管内的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数），与ACTIN的Cp值相减得到ΔCT值，2-ΔΔCT即为基因相对于ACTIN的相对表达量［24］。

2 结果与分析

2.1 碳纳米溶胶对烟株钾素含量及钾素积累量的影响

由图1可见，与对照（CK）相比，碳纳米溶胶处理（NC）下4个烟草品种的植株地上部钾素含量均有不同程度增加，除中烟100的增加量未达显著水平外，其余3个品种均达显著水平。RG17、鄂烟1号、云烟87钾素含量较对照分别增加14.0%、12.5%和30%，以云烟87的增加幅度最大，中烟100的增加幅度最小。说明碳纳米溶胶能够促进烟株对钾的吸收，增加烟株钾含量。

从单株钾素积累量变化来看，在碳纳米溶胶处理条件下，除RG17由于生物量增加较小，钾素积累量未达显著水平外，其他3个品种积累量均有显著提升；鄂烟1号、云烟87和中烟100积累量较对照分别增加18.6%、15.6%和46.6%。碳纳米溶胶处理下中烟100的钾素积累量显著高于对照，而图1中两者钾素含量无显著差异。初步分析认为，这是由于干物质积累增加对其钾素含量产生了稀释效应。

2.2 碳纳米溶胶处理对烟草根系K+流速的影响

由图2可见，在对照（CK）条件下，4个品种K+流速总体表现为内流趋势。中烟100的根系K+流速最初为外流，随着时间延长波动幅度较大，其他3个品种均表现为内流且波动幅度较小。经碳纳米溶胶处理后（NC），中烟100的根系K+流速逐渐变为内流，其他3个品种的内流速率均有不同程度增加。

与对照相比，碳纳米溶胶处理下RG17、鄂烟1号、云烟87和中烟100的根系K+流速分别增加38.17、39.71、13.96、8.61 pmol·cm-2·s-1（图3）。可见，碳纳米溶胶处理能促进根系对K+的吸收，但不同品种烟草对碳纳米溶胶的响应存在一定差异。

图3 碳纳米溶胶处理下不同品种根系K+流速的差异Fig.3 K+fluxes in roots of different varieties under carbon-nano sol treatment

2.3 碳纳米溶胶处理对K+通道基因表达量的影响

2.3.1 K+外流通道基因NTORK1的表达分析

由图4可见，4个品种的钾离子外流通道基因NTORK1在叶片中的表达规律不同，经碳纳米溶胶处理后，该基因在RG17、鄂烟1号和云烟87中的表达均有不同程度降低，而在中烟100中显著增加，增幅达126.9%。该基因在4个品种根系中的表达趋势一致，碳纳米溶胶处理的表达量相比对照均显著降低，RG17、鄂烟1号、云烟87和中烟100的降幅依次达到31.1%、59.9%、25.6%和32.0%。与对照相比，除NC叶片中中烟100的NTORK1表达量高于CK外，NC根系及其余品种的NTORK1在根和叶中的表达趋势大体相近，均低于CK。碳纳米溶胶诱导NTORK1表达量下调可能是其抑制K+外流，进而增加烟株钾素含量的重要原因。

2.3.2 K+内流通道基因NKT1的表达分析

由图5可见，各品种K+内流通道基因NKT1对碳纳米溶胶处理的响应不同。叶片中，除RG17外其他3个品种的表达量均增加。碳纳米溶胶处理下中烟100的表达量显著增加，其表达量是对照的4.64倍。在根系中，RG17和中烟100在碳纳米溶胶处理后，该基因的表达量降低；鄂烟1号和云烟87显著增加，增幅分别达到210.6%和130.9%。可见，经碳纳米溶胶处理后，基因NKT1的表达随着烟草品种和器官的不同而存在一定差异。

2.3.3 K+内流通道基因NtKC1的表达分析

由图6可见，K+内流通道基因NtKC1在叶片和根系中的表达情况相反，说明碳纳米溶胶诱导的K+通道基因的表达在烟草不同器官中有所差异。在叶片中，经碳纳米溶胶处理后，除云烟87表达量无变化外，其他3个品种均呈上升趋势，鄂烟1号和中烟100的表达量分别是对照的2.12倍和3.80倍。在根系中，与对照相比，经碳纳米溶胶处理后，K+通道基因在4个烟草品种中的表达量均降低，且均达到显著水平。其中，以RG17降幅最大（69.6%），鄂烟1号的降幅最小（30.8%），云烟87和中烟100的降幅分别为36.0%和66.8%。

图4 碳纳米溶胶处理下不同品种叶片（A）和根系（B）NTORK1的表达Fig.4 Expression of NTORK1 in leaves（A）and roots（B）of different varieties under carbon-nano sol treatment

图5 碳纳米溶胶处理下不同品种叶片（A）和根系（B）NKT1的表达Fig.5 Expression of NKT1 in leaves（A）and roots（B）of different varieties under carbon-nano sol treatment

图6 碳纳米溶胶处理下不同品种叶片（A）和根系（B）NtKC1的表达Fig.6 Expression of NtKC1 in leaves（A）and roots（B）of different varieties under carbon-nano sol treatment

3 讨论

研究表明，碳纳米材料能促进植物对大量元素［25-27］（N、P、K等）、中量元素［27］（Ca）和微量元素［28-29］（Cu、Zn、Fe、Mn等）的吸收，从而促进植物的生长发育。本研究中，施用碳纳米溶胶后，各烟草品种体内钾素的积累量均呈显著上升趋势，这与赵振杰等［25］、Joshi等［26］和Tiwari等［27］在烟草、玉米和水稻上的研究结果一致。可见，碳纳米溶胶在促进烟草钾素积累和提高钾含量方面具有突出优势，可成为农业生产中提质、减肥的有力工具。

非损伤微测技术（NMT）能准确检测植物根系对某种离子的吸收情况，表征进出植物细胞离子流的变化程度，为明确离子的吸收和流向提供直观、准确的数据［30-31］。本研究中，NMT测定结果表明，施用碳纳米溶胶后各品种的根系K+内流速率显著增加。通过测定K+通道基因的表达量发现，碳纳米溶胶处理下多数品种K+内流通道基因NKT1的表达量增加，该结果与杨健等［18］在烟草中的研究结果一致，此外，K+外流通道基因NTORK1的表达受到抑制，这与NMT所测定的K+动力学特征相符。可见，通过NMT测定的K+流速和流向，结合K+通道相关基因的表达，可为阐明碳纳米溶胶促进烟草对K+吸收的生理机制提供有力证据。

不同品种和不同基因型的烟草对钾素的吸收和利用率具有差异性，相关基因对外界条件的响应也存在显著差异［32-33］。在本研究中，碳纳米溶胶处理后K+通道基因NTORK1、NKT1和NtKC1的表达模式以及K+流速在不同烟草品种间存在一定的差异，可能是由于不同品种钾素吸收相关基因对外界条件响应的差异造成的，具体原因有待进一步研究。

4 结论

①碳纳米溶胶能促进烟草K+内流通道基因NKT1和NtKC1的表达，抑制K+外流通道基因NTORK1的表达，促使K+在根系的内流速率增加以及烟株钾素含量和积累量增加。②碳纳米溶胶诱导钾吸收相关基因表达和促进K+流速的效果因品种的不同而有所差异，不同基因对碳纳米溶胶的响应同样也存在差异。