王 璐，张 强，王艳萍，郭旭川，张文倩，朱春灏，曾维斌

（石河子大学 动物科技学院，新疆 石河子 832000）

新疆驴具有耐粗饲、抗寒、繁殖力强等诸多优良性能，在农牧民生产和生活中占有重要地位。随着驴及驴副产品的需求增加，有关驴奶、驴皮、驴肉的生产应用与相关研究逐渐深入[1-3]，然而生活方式的改变，导致新疆驴的役用价值逐渐下降，存栏量持续减少。研究新疆驴精液低温稀释液对高效利用优秀种公驴精液和加强品种保护具有重要意义。精液稀释液的成分对精液的质量有着较大影响[4]，所以配制合理的稀释液有利于精液的保存。研究表明，添加不同缓冲剂的稀释液对猪精液低温保存效果具有显著差异[5]，卵黄可附着于精子细胞表面，调节细胞内外电解质平衡，卵黄液冷保存精子后可提高精子的穿卵率[6,7]，添加一定比例的卵黄稀释液有利于驴精液的保存[8]，糖类在马精子等保存过程中发挥着重要作用[9,10]。人工授精技术因具有提高公畜精液利用率、方便母畜集约化管理等优势被大力推广。在实际生产中，精液稀释液在猪、牛等动物已获得普遍应用，通过精液稀释液来提高种公驴精液的保存品质正在逐渐引起人们的关注，而适用于新疆驴精液低温稀释液的相关研究较少。本研究通过逐步改进稀释液的配方，筛选对精液低温保存效果较好的稀释液，以期为提高新疆驴种公驴精液利用率和实现品种保护提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物

3头优秀新疆驴种公驴（石河子市九昌驴业有限公司提供），年龄为3～5岁，体况良好，无生殖系统疾病，按照种公驴培育管理技术规程进行饲养。

1.2 主要试剂及器材

柠檬酸、羟乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES）、柠檬酸钠、柠檬酸钾、葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、青霉素钾和硫酸链霉素均购自范德生物公司，三羟甲基氨基甲烷（Tris）购自北京索莱宝科技有限公司，自配低渗（HOST）液（果糖0.9 g，柠檬酸钠0.49 g，双蒸水100 ml，现用现配），倒置显微镜，恒温台。

1.3 试验方法

1.3.1 稀释液配方 试验先设置3种不同类型缓冲体系的配方（A1、A2、A3），在筛选出最佳缓冲体系后，设置含不同比例卵黄的稀释液配方（B1、B2、B3），再次筛选出最佳卵黄添比例，设置含不同糖类的稀释液配方（C1、C2、C3、C4）。具体精液稀释液配方见表1。

1.3.2 稀释液配置 准确称量各试剂，溶于双蒸水，滤纸过滤，高压灭菌10 min，冷却至室温备用。新鲜鸡蛋敲开外壳，无菌滤纸滚动去除卵黄表面的蛋清，注射器针头轻轻挑破卵黄，无针头注射器缓慢吸取卵黄液，注入冷却后的溶液中，最后加入青链霉素，磁力搅拌器搅拌30 min，所有稀释液均为现配现用。

表1 精液稀释液配方

1.3.3 精液采集与处理 假阴道法采集精液，经4～6层纱布过滤后，按照1∶1 体积比稀释精液，室温平衡30 min后，1 800 r/min离心10 min，弃上清，加入精液稀释液至原精液量的3倍。将装有精液的离心管以10层纱布包裹，置于5℃冰箱保存。每12小时翻动1次离心管，避免精子沉积。

1.4 精液品质指标及检测方法

精子活率检测：取适量精液于1.5 ml离心管，37℃水浴5 min，显微镜下随机5个视野，每次计数不少于200个精子，重复3次。统计所含的活精子数所占比例。

质膜完整性检测：取1 mlHOST液，37℃预热5 min，加入100μl精液，轻轻混匀，37℃水浴45 min。倒置显微镜下随机观察5个变化，每次计数不少于200个精子，重复3次。正常精子由于质膜膨胀而使尾部弯曲、形成环状，膜功能不完整的精子则不发生弯尾现象。统计所含的弯尾、环状精子数所占比例。

有效存活时间：每2小时观察1次精子活率，统计精子活率在0.50以上时的保存时间。

1.5 数据处理

采用SPSS19.0软件对数据进行单因素方差分析,结果以平均值±标准差表示。P＜0.05表示差异显著，P＞0.05表示差异不显著。

2 结果与分析

2.1 不同缓冲体系的稀释液保存效果

由表2可知，随着保存时间的延长，精液品质逐渐下降。1 d时，A3组精子活率、质膜完整性显著高于A1、A2组；在2～4 d，A1组精子活率、质膜完整性趋于0；4 d时，A3组精子活率、质膜完整性依然最高，分别为0.736±0.045、0.637±0.032；A 3 组精子有效存活时间为132.00±2.37 h。

以配方A3（B1）进行下一步试验。

2.2 不同卵黄比例的稀释液保存效果

由表3可知，在1～5 d，各组间精子活率差异不显著；6 d时，B3组精子活率显著高于B2组；7 d时，B3组精子活率显著高于B1、B2组，B1、B2组精子活率差异不显著。在2～7 d，B3组精子质膜完整性显著高于B1、B2组；在5～6 d，B2组精子质膜完整性显著高于B1，除5～6 d外，B1、B2组精子质膜完整性无显著差异。组间比较显示，各组间精子的有效存活时间差异显著，其中B3组最高，其次为B1、B2组。

表2 不同缓冲体系对精液低温保存品质的影响

表4 不同糖类对精液低温保存品质的影响

以配方B3（C1）进行下一步试验。

2.3 不同糖类的稀释液保存效果

由表4可知，在2～3 d，各组精子活率差异不显著，在5～7 d，C3组精子活率显著高于C1、C4组，C2、C3组间差异不显著；在6～7 d，C2组精子活率显著高于C1、C4组。在1～2 d、4～7 d，各组精子质膜完整性差异不显著，C3组精子质膜完整性显著高于C1、C2、C4组；在5～7 d，C1、C2组精子质膜完整性显著高于C4组。组间比较显示，各组间精子的有效存活时间差异显著，其中C3组最高，其次为C2、C1、C4。

3 讨论

3.1 不同缓冲体系对精液低温保存品质的影响

缓冲剂在精液的保存中具有至关重要的作用，HEPES作为非离子两性缓冲剂在维持精子活率方面要优于传统的无机缓冲剂，且具有螯合有害重金属离子的作用[11]。山羊精液在低温保存中，含HEPES的稀释液其保存效果好于“Tris+柠檬酸”稀释液[12]。食蟹猴精液在低温保存中，“Tris+柠檬酸”稀释液的保存效果好于含HEPES的TALP液[13]。本研究表明，3种缓冲体系稀释液中“HEPES+柠檬酸盐”稀释液的保存效果明显好于其他组。以上结果不同的原因除了可能与物种差异有关外，还可能是由于本研究的“HEPES+柠檬酸盐”稀释液中钠、钾离子可以维持细胞渗透压和跨膜静息电位，更有利于精子的长期保存。本研究发现，低温保存2 d内，精子活率存在波动现象，这可能与稀释液酸碱度和精子代谢造成精子假死状态的变化有关，此现象与部分报道结果相似[14,15]。

3.2 不同卵黄比例对精液低温保存品质的影响

卵黄作为一种缓冲物质，它能使精子适应渗透压变化较大的稀释液，但卵黄中的高密度脂蛋白、氨基酸经酶等会降低精子质量[16,17]，所以卵黄恰当的添加量有益于精子的保存。另外，卵黄通过促进精子与卵细胞透明带的结合，可提高精子的顶体反应（AR）率[18]。蓝狐精液稀释液中添加5%卵黄精子质量最好，其精子活率在第5天为0.559[19]，与本研究结果不同。马精液稀释液中添加8%卵黄时精子质量好于添加5%、0.8%的卵黄[20]。本研究同样发现，添加8%卵黄的稀释液可显著延长驴精液的低温保存时间，保存第5天时，精液活率仍高于0.700。

3.3 不同糖类对精液低温保存品质的影响

糖类是精液稀释液的主要成分之一，作为常用的非渗透性保护剂可通过糖酵解途径为精子代谢提供能量。而且糖类的羟基可以与精子膜磷脂的磷酸根结合置换周围的水分子，从而起到稳定膜结构和防止冰晶损伤的作用[21]。毛冉等[22]研究表明，鲜精稀释保存液中添加葡萄糖、果糖和D-半乳糖的混合糖，有利于维持精液品质和延长精子在体外的有效存活时间，其有效存活时间为57.70±6.3 h。徐文慧等[9]研究表明，葡萄糖分别与果糖、乳糖、棉籽糖及海藻糖两两组合低温保存，精液96 h以内TM差异不大。本研究表明，葡萄糖或“葡萄糖+果糖（或蔗糖）”的组合未达到比“葡萄糖+乳糖”更好的低温保存效果，优化后的“葡萄糖+乳糖”组，其有效存活时间可达215.00±3.46 h，与单独添加葡萄糖相比，“葡萄糖+蔗糖”组的精子活率降低较快，说明蔗糖可能不适用于新疆驴精液的低温保存。

4 结论

本研究结果表明，“HEPES+柠檬酸盐、8%卵黄、葡萄糖+乳糖”组合的稀释液适用于新疆驴精液的低温保存，有利于提高种公驴精液利用率和加强品种保护，可用于实际生产和长途运输。