邱山桐，张 昊，沈雅丽，潘阳阳，曾巧英，王 萌

（甘肃农业大学 动物医学院，甘肃 兰州 730070）

外泌体是指包含了多种mRNA、miRNA和蛋白质的微小囊泡[1]，直径30～150 nm，呈茶托形或一侧凹陷的半球形结构[2]，主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中[1-3]。外泌体在细胞间信息交流中发挥着重要作用，其携带的物质可作为疾病诊断的分子标志物[4]，也可作为药物载体靶向疾病部位[5]。外泌体在动物体液中分布广泛[6]，血清是从动物体内较为容易获取的体液。从血清中提取得到纯度较高的外泌体用于后期的疾病诊断有着较为重要的意义[7]。目前，关于小鼠血清来源的外泌体的分离方法研究较少。

本实验通过对小鼠来源的血清外泌体的密度梯度离心提取方法以及超高速离心法的提取方法进行比较，讨论这2种方法各自的优缺点，筛选出适合小鼠血清来源外泌体的提取方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

清洁级60日龄昆明系小鼠18只（2019.12.10购入12只，2020.10.10购入6只；均由兰州兽医研究所提供）；30%蔗糖溶液、3%磷钨酸染液；高速离心机（日立CT15RE）、超高速冷冻离心机（日立CP100NX）、透射电子显微镜（日立HT7700，兰州兽医研究所）。

1.2 试验方法

1.2.1 超速离心法 采用超速离心法提取小鼠血清外泌体，具体步骤如图1所示。将6只60日龄昆明系小鼠摘眼球采集小鼠血液，收集血液于离心管中，待血液凝固后，放入离心机中，3 000 r/min，4℃离心5 min，上清液即为血清。将上清液转移到新的离心管中，300 g，4℃离心10 min；取上清液转移到新的离心管中，2 000 g，4℃离心10 min；取上清液转移到新的离心管中10 000 g，4℃离心70 min；取上清液转移到新的超离管中，100 000 g，4℃离心70 min，弃上清，加入适量PBS缓冲液，使外泌体重悬与PBS缓冲液中；100 000 g，4℃离心70 min，弃上清，底部沉淀即为外泌体，加入200μl 4℃预冷的PBS缓冲液，使外泌体重悬与PBS缓冲液中，置于-80℃保存。

图1 超速离心法操作步骤

1.2.2 密度梯度离心法 采用密度梯度离心法提取小鼠血清外泌体，具体步骤如图2所示。将小鼠通过摘眼球采血，收集血液于离心管中，待血液凝固后，放入离心机中，3 000 r/min，4℃离心5 min，上清液即为血清。将上清液转移到新的离心管中，700 g，4℃离心10 min；取上清液转移到新的离心管中，10 000 g，4℃离心30 min，沿离心管管壁缓慢加入4 ml 30%蔗糖溶液，形成一单层后，100 000 g，4℃离心70 min，弃上清，将蔗糖层重悬于PBS缓冲液中；再以100 000 g，5.4℃离心70 min，将获得的沉淀物重悬于200μl 4℃预冷的PBS缓冲液中，所得沉淀即为外泌体，置于-80℃保存。

图2 密度梯度离心法操作步骤

1.3 外泌体的鉴定

利用透射电镜（transmission electron microscope,TEM）对外泌体进行鉴定。染色过程如下：采用负染色技术，载样铜网碳膜面朝上，分别滴加提取的外泌体混悬液20μl，室温静置3 min后用滤纸吸干液体，再加入30μl的3%磷钨酸溶液负染3 min，滤纸吸干、晾干，透射电镜下观察各组外泌体形态。

1.4 外泌体超速离心法的重复性检测

在2020年10月对6只60日龄昆明系小鼠用超速离心法提取小鼠血清中外泌体。利用透射电镜观察提取到的外泌体，与之前的实验结果进行比较，检验超速离心法的重复性。

2 结果

2.1 超速离心法外泌体结果

由超速离心法从小鼠血清中得到的外泌体在透射电镜下可观察到囊泡状外泌体结构，大小在100 nm左右，密度较小，放大观察可见背景较为清晰，结构清楚完整，便于观察（见图3）。提取到的外泌体在透射电镜的一个视野下含量较少，分布均匀。根据电镜下的观察结果，计算平均数，大致推算出每平方厘米有3.0×108个外泌体。

2.2 密度梯度离心法外泌体结果

由密度梯度离心法从小鼠血清中得到的外泌体在透射电镜下可观察到囊泡状外泌体结构，大小在100 nm左右，在透射电镜的一个视野内含量较多，分布不均匀，许多堆叠在一起，不是很方便观察形态，背景较为杂乱，判断杂质较多（见图4）。因外泌体分布不均匀且多个堆叠在一起，故无法估算外泌体个数。

图4 密度梯度离心法提取到外泌体

2.3 重复性

对同日龄同品系的小鼠通过超速离心法提取血清中外泌体。在电镜下进行观察，可观察到囊泡状外泌体结构，大小在100 nm左右，结构依旧清晰完整，可见标准的双层膜结构，分布较为均匀（见图5）。根据电镜下的观察结果，计算平均数，大致推算出每平方厘米有2.8×108个外泌体，与第一次提取的计算结果相近，由此可知超速离心法的重复性较好，均为500 nm比例尺下。

图5 不同批次小鼠血清超速离心法提取得到的外泌体

3 讨论与结论

本次实验结果显示出超速离心法在提取血清中外泌体中较密度梯度离心法纯度较高，分布较为平均，结构比较清晰，不会堆叠在一起，无须加入其他试剂，重复性较好，但耗时较长。密度梯度离心法提取的量较多，步骤较为简便，耗时较超速离心法少一些，但纯度不佳，得到的外泌体常堆叠在一起，在提取时需要加入蔗糖溶液，可能会对纯度要求较高的实验产生一定影响。

随着对外泌体了解的不断深入，它是目前已知细胞间信息较为合适的通信工具，其内蛋白质含有与信号转导相关的特异性蛋白[8]。外泌体中所携带的miRNA会参与体内的多种生物学过程，可以对机体内1/3以上的基因表达起到调控作用[9]。这些外泌体中的生物信息分子会随着疾病的发展而发生变化[10]。外泌体广泛存在于人和动物的血液中，可以稳定地提供具有特异性的疾病信息，且样本便于获得，对人和动物的伤害较小，方法便于推广。可以通过对信号分子进行筛选，找到不同疾病的生物标志物，通过提取血清中的外泌体对其内所含的信号分子进行识别，以达到快速诊断疾病、判断疾病分期、评价治疗效果的目的。

直接从血清中获取外泌体，并对其内的多种信号分子进行检测，拥有广阔的临床应用前景，因此对血清中外泌体提取方法的研究具有重要的实用意义。本次试验通过超速离心法和密度梯度离心法对同日龄同品系小鼠血清中的外泌体进行提取，并用透射电子显微镜进行观察，发现超速离心法在纯度和应用前景较密度梯度离心法更好，该结果与王飘飘[11]等人在巨噬细胞中和范式杰[12]等人在牛乳中利用不同方法提取外泌体得到的结论相似。

综上所述，在小鼠血清外泌体提取中，密度梯度离心法虽然耗时较短，步骤较少，但提取出的外泌体分布不均匀，大批堆叠在一起，不方便观察和进一步实验，且引入了其他试剂，会对纯度有要求的实验产生一定影响。超速离心法得到的外泌体结构清晰，分布均匀，纯度较高，故在小鼠血清的外泌体提取中超速离心法更好一些。在日后的研究中研究者可根据实验目的和材料对方法进行选择。