王泽祥，孙晓林

（甘肃农业大学动物医学院，甘肃 兰州 730070）

铅是人类最早使用的金属之一，其用途十分广泛，包括交通、涂料、农药、包装材料等诸多领域。铅是比重高于4.0 的重金属元素，也是对人体危害最大的几种重金属元素之一，其进入人体之后，会直接造成神经系统、造血系统、消化系统等器官组织的损害，危害人体健康[1-3]。由于近现代工业的迅猛发展和废物处理不当，近些年重金属的滥用和排放时有发生，尤其是对人体危害严重的铅[1]。因此根据国家法律和法规的规定，检查环境中重金属铅污染状况和监督食品中铅残留情况，对保障人民身体健康和食品安全是十分必要的。

传统的检测食品中重金属离子残留的方法主要有原子吸收光谱法（atomic absorption spectrometry）、气相色谱分析法（gas phase chromatography）、比色法（colorimetry）、电感耦合等离子体光谱法（inductively coupled plasma spectrometry）、电感耦合等离子体质谱分析（inductively coupled plasma-mass spectrometry）法、电感耦合等离子体-原子发射光谱（inductively coupled plasma-atomic emission spectrometry）法等，这些方法虽然有精确测量样品中单种重金属总量等优点，但是也有所需仪器昂贵，相对费力、费时，需要专业人员操作等缺点，因此难以应用到现场检测中[4-7]。随着免疫学检测技术的发展，重金属免疫学检测方法显现出其检测快速、陈本低廉、操作简单、选择性强的优点，如ELISA、免疫层析法、电化学发光检测法等[8-12]。这些方法是基于特异性抗体识别重金属离子的免疫分析方法，其中重金属完全抗原的制备与其抗体的制备及纯化是关键[13-15]。目前国外已有多种重金属ELISA 检测方法的报道[16-17]，而国内关于重金属免疫学检测方法的相关研究却很少。本研究利用兔多克隆抗体制备技术，采用制备的重金属铅鳌合抗原免疫新西兰大耳白兔，制备了抗重金属铅离子的特异性抗体，并运用凝胶过滤层析技术纯化制备的多克隆抗体，为建立快速、灵敏、特异的铅离子ELISA 检测技术奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试剂

DTPA 螯合剂、二甲基亚砜（DMSO）和葡聚糖凝胶Sephadex G200 均购自索莱宝科技有限公司；1mol/L Pb2+标准溶液、HEPES 缓冲液、三乙胺、弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂购自西格玛奥德里奇（上海）有限公司；牛血清白蛋白（BSA）购自生工生物工程（上海）股份有限公司；。

1.2 仪器与设备

pH（瑞士梅特勒-托利多公司）；超纯水仪（美国Millipore 公司）；磁力搅拌器（金坛市恒丰仪器厂）；冷冻离心机（湖南湘仪离心机仪器有限公司）；电泳仪（美国Bio-Rad 公司）；紫外分光光度计（美国Plextech 公司）；脱色摇床（海门市麒麟医用仪器厂），超滤离心管购自美国Millipore 公司。

1.3 实验动物

健康新西兰大耳白兔（2.0 kg 左右）购于中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物厂。

1.4 方法

1.4.1 金属铅离子完全抗原的制备

重金属铅离子免疫抗原的制备参考Blake、Zhu等报道的抗原合成方法[18-20]，首先称取50 mg 的DTPA 溶于15 mL DMSO 中，在磁力搅拌器中缓慢溶解20 min，制备成金属螯合剂溶液;称取100 牛血清白蛋白质（BSA）,溶于HEPES 缓冲溶液（10 mmol/L,pH 7.5）;将溶解的牛血清白蛋白溶液缓慢逐滴加入金属螯合剂溶液中，然后加入500 μL 三乙胺溶液，在磁力搅拌器中缓慢搅拌均匀后反应24h；使用预处理的超滤管（100 mmol/L EDTA 和0.1mol/L、pH 7.4 HEPES 缓冲液）4℃、6000rpm 离心超滤15 min去除未偶联的DTPA；应用pH 7.4 的HEPES 缓冲液将截留物洗取，然后将1mol/L 的Pb2+标准溶液500μL 逐滴加入，反应4h 后，4℃、6000rpm 离心超滤30 min 除去未鳌合的Pb2+，再用pH 7.4 的HEPES 缓冲液稀释截留物，-80 °C 保存备用。

1.4.2 抗原的鉴定

完全抗原应用SDS-PAGE 电泳鉴定，取BSA、DTPA-BSA、Pb-DTPA-BSA 分别用三蒸水稀释到适当浓度，煮沸10 min,灌制12%浓缩胶和5%分离胶，加入电极缓冲液，每控上样量10μL,Marker 按说明书处理，设定电压为60V,进行垂直SDS-PAGE电泳，电泳至溴酚蓝指示剂离底线1cm 时停止，考马斯亮蓝染色20～30min,脱色至透明。

1.4.3 完全抗原蛋白质质量浓度测定

运用紫外分光光度计测定重金属铅离子完全抗原中蛋白质的质量浓度。

1.4.4 多克隆抗体的制备

制备多克隆抗体的免疫动物为5 只体重2 kg的雄性新西兰大耳白兔，免疫前，抽取新西兰大耳白兔血清作为阴性对照。将制备好的免疫抗原0.5 mg与等体积的完全弗氏佐剂混合后制备成乳剂，以皮下多点注射的方式进行初次免疫。四周之后，取0.5 mg 免疫抗原与等体积不完全弗氏佐剂混合均匀，以多点皮下注射的方式进行第二次免疫，此后每14d运用0.5 mg 免疫抗原与等体积不完全弗氏混合均匀后免疫一次，在第5 次免疫后7d，以心脏采血方式采集兔血液，分离血清，血清于4℃保存。

1.4.5 多克隆抗体的纯化

取抗体血清运用Sephadex G-200 凝胶柱层析法纯化多克隆抗体。具体步骤：（1）Sephadex G-200凝胶沸水浴5h，冷却至室温后装柱，保证柱内无气泡且颗粒均匀。（2）用pH 7.4 PBS 缓冲液平衡、洗脱。（3）收集不同峰时的抗体，装入透析袋，周围堆积PEG6000 浓缩。浓缩后的多克隆抗体运用SDSPAGE 电泳（同1.4.2）检测纯度。

2 结果与分析

2.1 重金属铅完全抗原Pb-DTPA-BSA 的SDSPAGE 鉴定

通过蛋白质在SDS-PAGE 中的迁移率以判定各抗原的相对分子质量的改变。与BSA 相比，合成的DTPA-BSA 和Pb-DTPA-BSA 均存在滞后现象，说明相对于BSA，DTPA-BSA 和Pb-DTPA-BSA 的分子质量都有增大；况且，与DTPA-BSA 相比，Pb-DTPA-BSA 也存在滞后现象，说明Pb-DTPA-BSA比DTPA-BSA 分子质量增大更多，这些结果说明抗原合成成功(如图1 所示)。

图1 重金属铅完全抗原Pb-DTPA-BSA 的SDS-PAGE 鉴定

2.2 免疫抗原的蛋白质浓度

运用紫外分光光度计法测定的蛋白质浓度为3.4 mg/mL（见表1）

表1 抗重金属铅免疫抗原浓度

2.3 SDS-PAGE 电泳鉴定抗体的纯度

运用凝胶柱层析法对制备的重金属铅多克隆抗体进行纯化，根据蛋白分子Marker 标记，纯化后的抗重金属铅多克隆抗体纯度达到80%以上（如图2 所示）。

图2 重金属铅多克隆抗体纯化的SDS-PAGE 鉴定

3 讨论

重金属免疫学检测方法具有灵敏度高、检测速度快、选择性好、所需设备价格低廉等优势，十分符合对动物性食品中重金属铅的检测需求。重金属ELISA 检测方法以抗体技术为基础，运用过量螯合物与样品中的重金属离子制备成复合物，在酶标板上包被金属-螯合物-蛋白质复合物抗原，二者竞争性结合抗体位点，应用二抗显色后，与标准曲线对比得出重金属离子的含量。因为重金属铅离子的分子量小、无法形成抗原表位，所以它只是半抗原，缺乏免疫原性[21-22]。因此，重金属铅完全抗原的合成和重金属铅抗体的制备是ELISA 检测方法成功建立的关键点，常用的抗原制备技术有戊二醛法、重氮化法、异硫氰脂法等[23-26]。目前，双功能螯合剂法制备重金属完全抗原的报道很少，而且重金属铅抗体的制备方法仍以使用实验动物小鼠的少量制备为主[27]，未见使用实验动物兔的大量制备并纯化的相关研究。本实验应用双功能螯合剂DTPA 制备重金属铅的完全抗原，运用紫外分光光度计法测定完全抗原的浓度，通过SDS-PAGE 对完全抗原的合成进行了鉴定，随后使用完全抗原免疫实验动物新西兰大耳白兔，制备多克隆抗体，并应用凝胶过滤层析技术纯化多克隆抗体，SDS-PAGE 检测显示出重金属铅多克隆抗体的纯化成功。该研究系国内首次制备和纯化重金属铅兔多克隆抗体，将为下一步动物性食品中重金属铅ELISA 检测方法的建立提供准备。

4 结论

本研究成功制备重金属铅的完全抗原Pb-DTPA-BSA,紫外分光光度计法测定其浓度为3.4mg/mL，应用免疫抗原Pb-DTPA-BSA 免疫家兔，成功制备抗重金属铅多克隆抗体，凝胶柱层析法纯化获得高纯度抗重金属铅多克隆抗体。