王文华，李秀婷，徐友强，李微微，孙宝国*

（1 北京食品营养与人类健康高精尖创新中心 北京工商大学 北京100048 2 北京市食品添加剂工程技术研究中心 北京工商大学 北京100048）

邻苯二甲酸酯类 （Phthalate Esters，PAEs）因在提高塑料制品稳定性、柔韧性、凝聚力和防水性能等方面具有优良特性，故自20 世纪50年代起被广泛添加到各种塑料制品中[1-2]。目前全球PAEs的年消耗量高达6 800 万t[3]，主要用于建筑、汽车、医疗产品、电线和电缆行业；也用作油漆、黏合剂、化妆品和润滑剂的添加剂[2]。PAEs 与塑料非共价连接，很容易从塑料中浸出和迁移到周围环境基质中[4-7]。由于大量生产和广泛使用，因此PAEs在不同环境中被频繁检出[8-12]。环境中的PAEs 会通过食物链对水生生物和人类健康产生负面影响[13]。如PAEs 可与雌激素受体结合，引起激素紊乱[14]；干扰内分泌系统[15]；诱导生殖毒性[16-17]，肝脏过氧化物酶体增殖[18]，肝细胞肿瘤[19]；诱发儿童肥胖[20]，并可能危害胎儿健康[21]。

随着对其危害的逐步认识，PAEs 引发的健康问题成为人们关注的焦点，美国环保局已将最常见的PAEs 列为优先控制环境污染物[22-23]。除了在水体、土壤检测到PAEs 外，水稻、小麦、高粱等农作物中也不同程度地被检出邻苯二甲酸二甲酯（Dimethyl phthalate，DMP）、邻苯二甲酸二乙酯（Diethyl phthalate，DEP）、邻苯二甲酸二丁酯（Dibutyl phthalate，DBP）、邻苯二甲酸二异丁酯（Diisobutyl phthalate，DiBP）、邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯〔Di（2-ethylhexyl）phthalate，DEHP〕[24]，可能通过饮食摄入增加人体健康风险。高效降解邻苯二甲酸酯成为解决这一问题的关键。

在自然条件下，PAEs 结构稳定，其水解、光解速度非常缓慢，属于难降解物质[25-26]。在去除邻苯二甲酸酯的研究中，细菌降解的主导作用被广泛报道，成为环境中去除PAEs 的主要微生物[1，27]，且新的高效降解细菌不断被发现，如从白酒曲中筛选获得1 株康氏副球菌 （Paracoccus.kondratievae）BJQ0001，对PAEs 降解有重要作用[28]。

本试验从酒醅中分离出1 株可有效降解DBP的不动杆菌属细菌，命名为Aci-17。利用GenBank上已知酯降解基因序列的高度同源区设计引物，从菌株Aci-17 基因组中克隆出1 个全长1 077 bp 的酯键水解酶基因，其重组表达蛋白除了具有高效降解DBP 能力外，还可高效降解DMP、DEP、DiBP。借助生物信息学软件对其进行生物信息学分析，在I-TASSER 在线建模基础上，通过Est96蛋白与配体分子对接方法，探究Est96 催化邻苯二甲酸酯生物降解机制，以期为邻苯二甲酸酯生物降解提供重要依据。也为不动杆菌Aci-17 的后续开发利用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

不动杆菌Aci-17 从酒醅中分离获得，聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）引物委托北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成，基因测序委托华大基因完成。细菌基因组DNA 提取试剂盒、大肠杆菌（E.coli）DH5α 感受态细胞、大肠杆菌BL21 感受态细胞，购自天根生化科技（北京）有限公司；克隆载体pMD18-T、Trans Taq-T DNA聚合酶、NovoRecRPCR 一步定向克隆试剂盒、表达载体pCold-TF，购自北京全式金生物技术有限公司；其它化学试剂均为国产分析纯试剂。

1.2 培养基

MSMY 培养基：根据Li 等[29]在矿物盐培养基（mineral salt medium，MSM）基础上添加酵母膏成分的改良矿盐培养基；DBP 溶解在二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）中，并在加入培养基之前通过0.22 μm 的无菌膜过滤。

LB 培养基：酵母膏（5.0 g/L）、胰蛋白胨（10.0 g/L）和氯化钠（10.0 g/L）。

1.3 仪器与设备

EPS301 琼脂糖凝胶电泳仪、DYY-III-8B 稳压稳流电泳仪，北京六一仪器厂；ImageQuant 300凝胶成像仪、Multitemp Ⅲ恒温循环水浴器，美国GE 公司；HR60-IIA2 生物安全柜，青岛海尔特种电器有限公司；Microfuge 20R 高速冷冻离心机，美国Beckman Coulter 公司；T100-Thermal cycler PCR 仪，美国Bio-Rad 公司；立式压力蒸汽灭菌器，上海博迅实业有限公司医疗设备厂。

1.4 方法

1.4.1 Aci-17 对DBP 的生物降解 参考Xu 等[28]的方法，将Aci-17 在LB 培养基中活化培养后，细胞培养物（体积分数2%）接种到含DBP 的MSMY培养基中，DBP 最终质量浓度分别为200，400，600 mg/L 和800 mg/L。试验设置3 个平行。在96 h 培养期内每隔12 h 收集细胞培养样品（10 mL），加入正己烷（2 mL），将所有试剂转移到50 mL 管中并剧烈混合30 s。13 000×g 下离心5 min，收集上清液，0.22 μm 无菌膜过滤，使用气相色谱定量测定残余的DBP。

1.4.2 16 S rDNA 测序 离心收集过夜培养Aci-17 菌体，按照细菌基因组DNA 试剂盒操作步骤提取基因组DNA，检测其纯度合格后，以细菌总DNA 为模板，16S 通用引物扩增16S 序列。反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30 个循环；72 ℃再延伸10 min。PCR 产物送至华大基因测序有限公司测序。将测序结果与美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）数据库中核酸序列进行比对，选取同源性高的菌株的16S rDNA 序列，利用MEGA 7.0 软件进行多序列比对，用邻接（Neighbor-Joining）法构建系统发育树。

1.4.3 基因Est96 克隆、重组载体构建及蛋白诱导表达 根据文献报道具有降解PAEs 能力的不动杆菌LMB-5 全基因组信息[30]及GenBank 上已知的不动杆菌酯酶基因序列 （GenBank 登陆号：AGY55959.1，AFK31309.1，AEW03609.1，WP_163143359.1，HAK15034.1，ENV65051.1，OJU 85238.1，EPH30775.1），利用序列的高度同源区设计目的基因保守区简并引物 （表1），PCR 扩增获得基因保守序列，依据保守区域测序结果及高度同源序列设计全长引物（表1），以Aci-17 基因组DNA 为模板PCR 扩增，扩增条件：94 ℃、5 min；94℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、2.5 min，循环30 次；72℃、10 min。1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物条带，送至华大基因进行基因序列测定。

表1 克隆表达过程使用引物Table 1 Primers used for amplification and recombinant construction of expression vector

使用根据In-Fusion 设计含EcoRⅠ酶切位点的引物将目的基因克隆至原核表达载体pCold-TF 载体，将重组质粒pCold-TF-Est96 转化到E.coli BL21 （DE3）中，选择测序正确的转化子摇瓶培养至OD600值达0.6～0.8 时加入终浓度为50 mmol/L 的IPTG，在20、200/min 条件下培养20 h，13 000×g 离心5 min 收集菌体，Tris-HCl 洗涤2次后悬浮细胞，超声破碎，离心取上清即为Est96粗酶液。

1.4.4 酯酶Est96 生物信息学分析

1.4.4.1 酯酶Est96 氨基酸序列及基本性质分析 氨基酸序列来源于NCBI 数据库中蛋白质序列；多序列比对借助Clustal Omega 和ESPript 3.0在线分析获得；ExPASy-ProtParamtool 和SignalP 4.1 Server 预测工具用于对Est96 蛋白的理化性质和信号肽分析。

1.4.4.2 亲/疏水性及跨膜区分析 蛋白亲水/疏水性分析由Expasy 网站ProScale 工具完成，蛋白跨膜区预测采用在线软件TMHMM 2.0 进行。

1.4.4.3 二级、三维结构预测 在线提交Est96 氨基酸序列至SOPMA Secondary Structure Prediction Method 完成蛋白二级结构预测；三维结构预测由I-TASSER 服务器在线计算完成。所用生物信息学在线分析工具见表2。

表2 生物信息学在线分析工具及网址Table 2 Bioinformatics online programs and web sites

1.4.5 酯酶Est96 功能验证 参考Xu 等[28]的方法，反应混合物在30 ℃，200 r/min 反应12 h，反应结束，如1.4.1 节所述方法制备样品用于气相色谱分析。

1.4.6 分析方法 参考Xu 等[28]方法，采用Agilent7890B 气相色谱系统，色谱柱为Agilent 19091 Ne-213I 柱（30 m×0.32 mm×0.50 μm），以80 ℃恒温5 min，20 ℃/min 的速率升温至240 ℃，最后240 ℃保持恒温25 min，进行定量分析。载气为氮气，流速1.0 mL/min，进样量1.0 μL。Origin8.0 软件用于统计分析，t 检验分析数据的统计学意义。

1.4.7 分子对接 为深入了解酯键水解酶Est96在DMP 降解过程中与配体间相互作用，对两者进行了分子对接。使用PubChem 化合物数据库检索并获得DMP 的SDF 格式[31]，借助Pymol 2.4.1 转换为PDB 格式[32]。使用软件AutoDockTools 1.5.6打开处理过的受体分子（Est96 酯酶）和配体分子（DMP）[33]，选定对接中心点区域三维坐标，即X=69.113，Y=57.253，Z=64.025，选择I-TASSER 预测的Est96 活性位点作为潜在结合位点创建对接受体网格盒的空间为24Å×24Å×22Å，网格间距0.375 Å，进行100 轮次拟合对接分析。选取具有最低结合能值的构象进行分析，使用Discovery Studio 2020 在2D 层面上分析Est96 与DMP 形成的作用力，使用Pymol 2.4.1 对Est96 与DMP 在3D 空间形成的作用力进行分析。

2 结果与分析

2.1 Aci-17 对DBP 的生物降解

在以DBP 为唯一碳源的MSMY 培养基中，DBP 初始质量浓度分别为200，400，600 mg/L 和800 mg/L 时，每24 h 测定培养基中残留的DBP质量浓度，经过Aci-17 的生物降解，残留DBP 质量浓度与降解时间关系曲线如图1所示，随降解时间延长，体系中DBP 残留量逐渐减小，96 h 时初始质量浓度为200，400，600 mg/L 和800 mg/L的样本中DBP 降解率分别为100.00%，78.20%，84.66%，64.11%。DBP 的初始浓度会影响Aci-17对DBP 的降解速率。

图1 Aci-17 降解不同初始质量浓度DBPFig.1 Degradation of different initial concentrations of DBP by Aci-17

2.2 16S rDNA 鉴定

图2 Aci-17 基因组、16S PCR 扩增电泳验证图及16S rDNA 基因序列构建系统发育树Fig.2 Identification of extracted genome，16S PCR products and based phylogentic trees for 16S rDNA gene sequence of Aci-17

提取Aci-17 基因组DNA 电泳检测如图2a显示，没有明显的拖尾现象。以基因组DNA 为模板，进行16S rDNA 扩增，琼脂糖凝胶电泳条带清晰且片段大小在1～2 kb 之间（图2b）。将PCR 扩增的16S rDNA 片段序列提交至GenBank 数据库进行相似性分析，通过Clustal X 软件多重比对后，用MEGA 6.0 软件中的Neighbor-Joining 法构建系统发育树（图2c）。

2.3 Est96 克隆、重组载体构建及蛋白诱导表达

以Aci-17 基因组DNA 为模板简并引物PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳检测显示200～250 bp 有明显条带（图3a），DNAMAN 软件分析测序结果显示保守区序列长度为237 bp，依据此保守区序列及高度同源序列设计全长引物进行PCR 扩增，获得编码框全长1 077 bp 的Est96 基因（图3b）。

按照1.4.3 节中方法得到Est96 粗酶液，SDSPAGE 电泳检测结果显示（图3c），目的蛋白有单一且清晰的条带，与预测大小相吻合，表明Est96成功表达为可溶性蛋白。

2.4 酯酶Est96 生物信息学分析

2.4.1 酯酶Est96 多序列比对及基本性质分析利用ESPript3.0 在线程序导出的序列对比图 （图4）显示Est96 与水解酶第Ⅳ家族氨基酸序列具有较高保守性，Est96 具有水解酶第Ⅳ家族的GXSXG 保守基序和HGGG 氧阴离子孔结构，及1个由亲核残基Ser201，酸性残基Asp253 和1 个保守His325 组成的典型丝氨酸水解酶催化三联体，亲核残基Ser201 位于Gly199-Asp200-Ser201-Ala202-Gly203 保守基序中。在大多数水解酶第Ⅳ家族中，活性位点丝氨酸存在于经典的GXSXG 保守基序中[30，34]，GXSXG 保守基序与PAEs 的降解密切相关[35-38]，Est96 氨基酸序列中的GXSXG 保守基序中的第1 个X 是Asp，第2 个X 是其它邻苯二甲酸酯酶中常出现的非极性残基Ala，GDSAG这个基序在丝氨酸水解酶中是独特的[39]。典型催化三联体的序列相似性和保守性表明，邻苯二甲酸酯水解酶中重要的共同功能的基序在进化过程中一直是保守的。HGGG 四肽基序位于高度保守的五肽基序上游，其在水解过程中与疏水结合口袋有关[40]。在其它细菌如热棒菌属（Pyrobaculum，BAC06606.1）、嗜酸硫化杆菌 （Sulfobacillus acidophilus，AEW03609.1）、鞘脂菌属（Sphingobium，AJO67804.1）、芽孢杆菌属（Bacillus，AAU04567.1）酯酶序列中也是保守的。

通过ExPASy-ProtParam 工具对Est96 基本性质进行分析，显示Est96 是由358 个氨基酸残基组成的多肽链，分子质量40.66 ku，预测等电点9.23，带正、负电荷氨基酸分别为42 和32，分子式为C1835H2863N511O516S10，原子总数5 735，消光系数39 560，含量最高的氨基酸为异亮氨酸（9.5%），不稳定系数46.45，脂肪族指数88.02。Est96 不稳定指数大于40，表明该蛋白为不稳定蛋白。研究发现，蛋白质的不稳定性可能由其序列中某些氨基酸的顺序决定[41]。以上基本酶学性质的分析有助于后续蛋白质的分离纯化及性质研究。

图3 Est96 基因保守序列、全长序列电泳检测及Est96 诱导表达SDS-PAGE 分析Fig.3 Electrophoresis analysis of coreing sequence and full-length sequence of Est96 and analysis of SDS-PAGE for Est96

图4 Est96 与脂肪酶第Ⅳ家族其它5 个蛋白的序列比对Fig.4 Protein sequences alignment between Est96 and other homologs from the family Ⅳ

将Est96 氨基酸残基序列递交SignalP 5.0区域。因此，生物信息学分析结果说明Est96 存在于胞内。Server，显示信号肽（Sec/SPI）为0.0123，双精氨酸易位信号肽（Tat/SPI）为0.0006，脂信号肽（Sec/SPII）为0.0008（图5），结果表明Est96 不具有信号肽序列。没有信号肽的引导，新合成的蛋白质不能发生转运，即翻译完毕的蛋白会滞留在合成的

2.4.2 亲/疏水性及跨膜区分析 采用Protscale在线软件Hphob/Kyte & Doolittle 算法计算Est96蛋白的疏水性 （图6a）。位于320 位的异亮氨酸（Ile）疏水性最强，分值-2.433。位于229 位的脯氨酸（Pro）亲水性最强，分值1.878。亲疏水预测结果显示Est96 蛋白的疏水区域少于亲水区域，属于亲水蛋白。采用TMHMM 2.0 进行蛋白跨膜区预测结果（图6b）显示蛋白无跨膜结构，属于胞内蛋白。

2.4.3 二级、三维结构预测 二级结构预测表明，Est96 中α-螺旋占蛋白质43.85%，伸展链占蛋白质13.97%，β-折叠占蛋白质6.42%，无规则卷曲占蛋白质35.75%。可见，对于Est96 而言，α-螺旋和无规则卷曲是蛋白结构的主要组成部分。

借助I-Tasser 在线服务器对Est96 三维结构进行建模，模型预测得分C-Score 为0.74（置信区间为-5-2），TM-Score 为0.62±0.14，表明模型预测具有良好的准确性和合理性，可用于后续分子对接。建模结构分析显示Gly129、Gly130、Val133、Ser201、Ala202、Val 230、Val 257、His325 是与酯酶活性相关的活性位点，为后续分子对接提供基础。

图5 Est96 信号肽预测Fig.5 Prediction of the signal peptide of Est96

图6 Est96 疏水性分析与跨膜区预测Fig.6 The hydrophobicity analysis and prediction of transmembrane domain of Est96

2.5 酯酶Est96 功能验证

以DMP、DEP、DiBP、DBP、DEHP 为底物验证Est96 对PAEs 降解作用。结果表明Est96 能高效降解短侧链PAEs（图7），对体系中的DMP 降解率达99.996%，Est96 催化分解了体系中超过95%的DEP、DiBP 和DBP。然而，其中DEHP 降解率低于30%，这一结果可能与侧链碳原子数量多的PAEs 空间位阻大、不容易被微生物降解利用的报道一致[1]，随着侧链碳原子数量的增加，PAEs 的水溶性呈下降趋势，同时长侧链影响酶反应的空间效应，微生物更倾向于降解DMP、DEP、DBP、DPP和BBP 等短侧链PAEs[1，42-43]。重组蛋白对5 种PAEs 降解特性表明，该蛋白对短侧链PAEs 具有较高降解效率。

图7 Est96 对DMP、DEP、DiBP、DBP和DEHP 的催化降解Fig.7 The degradation of DMP，DEP，DiBP，DBP and DEHP by Est96

2.6 分子对接

基于Est96 对DMP 降解效率最高的试验结果，采用诱导契合策略，将DMP 对接到Est96 活性部位，活性位点以及底物结合位点在单体内完成，受体分子和配体之间通过空间匹配和能量匹配相互识别并形成分子复合物，得到DMP 的最佳取向，对接打分为-5.8 kcal/mol。

图8 Est96 与DMP 相互作用的分子对接图Fig.8 Molecular docking analysis of Est96 with DMP

借助PyMOL 2.4.1 可视化工具分析Est96 与DMP 分子对接结果，DMP 结合在Est96 催化活性口袋中（图8A，C），His127-Gly128-Gly129-Gly130、Gly199-Asp200-Ser201-Ala202-Gly203、His325-Gly326-Phe327 3 个保守结构域是催化活性口袋的重要组成 （图8B、C）。DMP 与Ser201 残基、Asp253 残基和His325 残基形成稳定的四面体过渡态（图8B），经典的催化三联体“丝氨酸残基-天冬氨酸-组氨酸残基”被认为是酯键羰基碳原子上亲核攻击的原因，这种四面体过渡状态保证了酯键水解的催化作用[44]。DMP 分子酯基中的氧原子作为氢键的受体，与Est96 上一个高度保守域的His325 氨基酸侧链形成氢键（图8B、C），氢键键长为2.5Å。研究表明氢键是酶与配体相互作用的关键作用力[45]，参与氢键形成的His325 氨基酸残基被认为是Est96 与小分子配体相互作用的关键残基。配体DMP 的苯环与Phe66 形成π-π 堆积，与Met 82 形成了π-二硫键的相互作用稳定酶-底物复合体，与结合口袋牢固结合。已有研究证实亲核丝氨酸残基和氧阴离子空穴的残基对酶的催化功能至关重要，这些位置的定点突变导致酶功能的丧失[46-48]。

3 结论

从中国传统白酒酿造过程中分离鉴定出1 株有效降解DBP 的不动杆菌属细菌Aci-17，通过克隆和重组表达菌株Aci-17 中的1 个酯键水解酶编码基因，验证了该基因表达蛋白Est96 对谷物中常见的5 种邻苯二甲酸酯降解效率。结果表明，Est96 不仅能够降解DBP，还可高效降解DMP、DEP、DiBP。同时，在邻苯二甲酸酯降解过程中Est96 显示底物偏好性，优选烷基侧链短而直的邻苯二甲酸酯作为底物。