张春红，黄正金，樊苏帆，闾连飞，李维林，吴文龙

(1 江苏省中国科学院植物研究所，南京，210014； 2 南京林业大学林学院，南京，210037)

蓝莓(Vacciniumspp.)为杜鹃花科(Ericaceae)越桔属(Vaccinium)灌木特色小浆果果树[1]，其果实因具有丰富的花青素、黄酮及其他酚类物质而可以改善视力、提供抗癌物质及减轻心脏病风险等[2]，近年来被认为是最富有综合价值的浆果之一[3]。蓝莓基因组研究总体仍较落后，加上育种周期长，分子标记在遗传育种上的应用仍处于起步阶段。SSR(Simple Sequence Repeats)是20世纪80年代发展起来的一种新型DNA标记，多态性丰富且呈共显性，已被广泛用于多种果树品种鉴定、种质资源研究、遗传图谱构建及标记辅助选择等[4]，其中种质遗传多样性鉴定是资源创新利用的关键基础环节。越桔属植物种质资源丰富，根据蓝莓长势特点和生物生态学特性，蓝莓种群划分为 3 个栽培类型，包括高丛蓝莓、矮丛蓝莓及兔眼蓝莓，其中高丛蓝莓又分为北高丛蓝莓、南高丛蓝莓和半高丛蓝莓[5-6]。目前国内外已有利用EST-SSR和基因组SSR进行越桔属野生和栽培资源遗传样性分析的报道[7]。近年来，不仅有国外学者利用EST-SSR引物进行了蓝莓品种种质的遗传多样性和种群结构分析[8]，也有用其分析野生和栽培种的遗传多样性的研究[9]。崔建明等[10]和孙英新等[11]分别利用SSR和EST-SSR引物对越桔属种质资源进行了分析，揭示了不同种质资源的遗传狭窄，需加强野生资源和种间资源的利用。近年来，尽管利用不同分子标记技术开展蓝莓遗传多样性和亲缘关系分析和品种鉴定已经取得很多进展，但与其他园艺作物相比，SSR标记在蓝莓上的应用研究还有很大的空间[12]。

目前商业化栽培的高丛、矮丛和兔眼蓝莓，因需冷量差异及不断的渐渗杂交和染色体多倍性等原因[13]，使得品种遗传背景较为复杂，生产上品种的选育也多源于种间杂交。不同类型的蓝莓其选育目标不同，因此应对染色体数目相同种的不同遗传基础进行详尽揭示。为了合理利用蓝莓品种资源，选育适于南方气候类型的高丛和兔眼蓝莓品种，有必要利用现代分子标记手段对其遗传变异基础进行解析。本研究即基于文献已报道EST-SSR和SSR分子标记信息，利用多态性好的标记对目前主栽的高丛和兔眼蓝莓品种间的遗传多样性进行分析，以期为品种鉴定和利用、杂交组合配制和杂交育种亲本选择提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究材料

供试材料为国外引进和自主选育的品种品系66份，其中包括19份兔眼蓝莓(R)，19份北高丛蓝莓(NHB)，28份南高丛蓝莓(SHB)，均种植于江苏南京溧水白马科学基地，各种质的名称、类型及系谱等信息见表1。采集各种质的幼嫩叶片，置于-80 ℃冰箱保存备用。

1.2 DNA提取

参照Takara植物DNA提取试剂盒(Code D9194)的说明书提取蓝莓基因组DNA，之后再用0.8%琼脂糖凝胶电泳法检测其质量。

1.3 SSR序列的设计及合成

蓝莓SSR和EST-SSR序列来源于文献中报道的蓝莓分子标记[7，14]。初步设计了56对序列引物，将其编号为Vc1～Vc56(见表2)。引物由南京擎科生物科技有限公司合成。

1.4 SSR引物的扩增筛选

利用上述SSR和EST-SSR引物，扩增不同蓝莓种质的基因组DNA，进行各引物最适温度的筛选。PCR扩增反应体系的总体积为20 μL，其中包括1 μL 50 ng模板DNA、10 μL 的2×Taq PCR Master Mix(上海浦迪生物科技有限公司)、上游和下游引物10 μmol/L各1 μL，7 μL的ddH2O。94 ℃预变性5 min， 30个扩增循环，每个循环包括94 ℃变性30 s，复性(45～60 ℃)30 s，72 ℃延伸 30 s，最后72 ℃延伸10 min。扩增反应在ABI Veriti96 PCR仪上进行。采用8%的非变性聚丙烯酰胺进行PCR产物的电泳，150 V稳压电泳120 min。电泳结束后，用0.2% AgNO3染色后置于灯箱上拍照。将多态性好的引物对用于各种质基因组DNA的PCR扩增，根据条带扩增情况统计和分析。

1.5 SSR引物在蓝莓品种遗传多样性分析中的应用

将筛选到的多态性稳定的引物记录带型，将有条带的标记为带型“1”，无法正确辨别带型的以“0”表示，用于后续遗传多样性分析。通过分析带型，比较品种间多态性位点的差异，确定引物的多态率及多态信息量。使用NTSYS-pc Ver.2.10e软件进行UPGMA聚类分析，使用Picalc 0.6软件计算各引物的PIC值。

表1 蓝莓66份种质名称、类型及系谱信息

续表1

2 结果与分析

2.1 SSR引物多态性筛选

对56对SSR引物进行扩增，筛选引物适合温度及检测目的条带情况，所有引物均可以扩增出符合预期大小的条带。其中多态较好的引物为25对(见表2)，占引物数的44.64%，将其进一步用于蓝莓种质的遗传多样性分析。

2.2 多态性引物的扩增产物多态性

25对多态性引物中，多数引物扩增的位点数为5～7。25对多态性引物在66份蓝莓中检测到165个等位基因变异，平均每个SSR位点有6.6个，变幅为3～15个。多态性信息含量(PIC)为0.656～0.947，平均值为0.777。这些引物基本上能有效地检测出不同品种间材料的SSR差异位点，具有较高的遗传多样性。

基于遗传相似系数利用UPGMA法对66份蓝莓进行聚类分析，遗传相似系数为0.60～0.96。不同蓝莓品种明显按各自类型聚为3类，I、II和III类分别为兔眼蓝莓、北高丛蓝莓和南高丛蓝莓。兔眼蓝莓“红粉佳人”不同于一般的兔眼品种类型，而和南高丛蓝莓距离似乎更近，反映出该品种可能具有一些高丛蓝莓品种的遗传种质成分(见图1)。

从更细致地划分来看，第I类群19个兔眼蓝莓的遗传相似系数为0.62～0.96，巴尔德温、灿烂、昂丝罗、粉蓝、梯芙蓝和杰兔等6个品种似乎距离更近，推测与其系谱中均具有梯芙蓝种质成分有关。博尼塔、沃农、乌达德、精华、布莱特蓝距离较近，与其均具有“Callaway”种质成分有关。巨丰、巨蓝、顶峰、森吐里昂关系较为密切，也暗示其具有比较相似或接近的遗传种质成分。园蓝和“红粉佳人”品种则与其他兔眼蓝莓关系较远。第II类群19个北高丛品种的遗传相似系数为0.71～0.87，又细分为4个小的类群，甜心、蓝金、绿宝石和瑞卡关系较为密切，蓝港、斯巴坦、丹尼斯蓝距离较近，瑞贝尔、奥罗拉和公爵亲缘关系更近，其余9个品种距离似乎更近。第III类群28个南高丛品种的遗传相似系数为0.62～0.92，从分类上近乎可以分为3个小的类群，天后、珠宝、阳光蓝和玉蓝亲缘关系较近，海岸、顶级、库珀、奥尼尔、明星、奥扎克蓝、安娜几个品种距离更近。其余17个品种明显聚为一类，其中自主选育的寨选3号、4号、5号、7号、8号和9号与大果蓝金亲缘关系最近，推测其之间可能存在相似的遗传种质成分。

25对多态性引物中，多态性最高的Vc26可检测到15个等位基因数目(见表2、图2)，其次是Vc42和Vc13，分别可以检测到13和10个等位基因数目(见表2)。Vc25、Vc36、Vc49、Vc56分别可以检测到6、9、8、5个等位基因数目，扩增所示见图2，扩增产物条带清晰，且在不同类型蓝莓种质中区别明显，或可以用于不同材料的区分。

表2 蓝莓多态性SSR引物序列及检测多态性情况

续表2

图1 基于遗传相似系数的66份蓝莓品种聚类分析

注：5对多态引物Vc26、Vc25、Vc36、Vc49和Vc56分别能检测出15、6、9、8、5个等位基因位点类型； 编号R1～R19、N1～N19、 S1～S28分别对应表1中的品种编号。M为50 bp DNA 分子量标准。

3 结论与讨论

蓝莓起源于北美，于20世纪80年代引进我国，随着大面积推广种植，蓝莓栽培面积稳步增加，发展区域由东北地区到长江流域均有种植，具有巨大的市场前景。目前我国蓝莓育种研究总体尚处于引种和繁育推广阶段，自育品种少，随着生产中引进品种退化问题逐渐显现，加上国内检疫和国外对于品种知识产权的保护使得引种受限，加强现有蓝莓种质资源遗传基础解析加以育种利用迫在眉睫。利用多种类型分子标记开展蓝莓种质遗传多样性分析的研究均有一定的报道[12]，其中SSR标记被认为是可用于评价不同类型蓝莓遗传基础的有效方法[9]。本研究基于目前南方地区生产上种植应用的高丛和兔眼蓝莓种质，利用多态性较好的SSR和EST-SSR标记揭示其遗传基础，以期用于辅助育种，发掘更多有价值的种质资源的信息。

本研究利用25对具有多态性的引物对66份蓝莓种质资源进行了鉴定，多态性信息含量PIC平均值达0.777，表明这些引物的扩增产物具有丰富的多态性，可以有效用于这些种质的亲缘关系分析。基于北高丛、南高丛和兔眼蓝莓3种类型聚类分析的结果，遗传相似系数为0.60～0.96，不同类型之间分类明显，不同类型内亚群的距离远近与其系谱信息有着一定的关联性。由聚类分析的结果推测不同类型种质可能具有不同倍性，兔眼蓝莓多为六倍体，与四倍体和二倍体种质具有较远的遗传距离[14-15]。兔眼蓝莓“粉红佳人”虽然系谱中含有巨丰的遗传成分，但两者并未聚到一起，推测与可能有其他遗传成分占优势有关，其聚于兔眼和北高丛品种类型之间，反映出该品种可能也具有一些高丛蓝莓品种的遗传种质成分。从聚类图看，尽管南高丛蓝莓从兔眼和北高丛蓝莓中衍生而来，南高丛与兔眼蓝莓的距离似乎远于南高丛和北高丛，究其原因可能在于选用的分子标记多来源于北高丛蓝莓或南高丛品种的基因组重组倾向于形成四倍体[14]。总体上，19个兔眼蓝莓依据遗传相似系数0.62～0.96分为4个不同的小类群，19个北高丛蓝莓根据相似系数0.71～0.87分为5个小类群，28个南高丛蓝莓根据遗传相似系数0.62～0.92分为3个小的类群，不同种质之间亲缘关系较近的明显距离较近。此外，本研究也发现有9个品种尚未查询到系谱信息，这些品种的遗传种质成分或与其他品种的亲缘关系或可以根据其在聚类图中的位置进行推测，如北高丛类型的甜心与蓝金距离较近，圣蓝与钱德勒距离较近，南高丛类型的天后与珠宝距离较近，安娜与奥扎克蓝距离较近，追雪和春高与薄雾较近，脆蓝、卡米尔和温莎三者距离最近。笔者自主选育的寨选3、4、5、7、8、9号品种相距较近，且与大果蓝金相距最近，证实了其均是大果蓝金的自选系后代。

SSR标记为蓝莓种质资源鉴定、遗传多样性分析及遗传图谱构建提供了快速可靠的手段，越来越多优良标记的发掘为越桔属基因组和蓝莓育种研究提供了有价值的线索[16]。本研究筛选出了多态性较好的25对SSR引物，利用其多态性揭示了3种不同类型蓝莓栽培种质的差异，研究结果不仅为蓝莓品种鉴定提供了引物选择，也有利于不同种质的遗传研究和在育种中的利用。本研究分析发现，目前引种蓝莓种质遗传基础相对较窄，杂交育种中应拓宽亲本来源和加强野生资源的收集利用，这对今后杂交育种中亲本的选用具有一定借鉴意义。