李慧，邢学勇，王一新，杨爽，赵丽，郭俊华

1.新乡医学院第三附属医院，河南 新乡453000；2.河南大学，河南 开封475000

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一种气流受限、伴有气道高反应性的呼吸道疾病，表现为肺功能下降，对患者生存质量造成严重影响［1］。COPD发病过程复杂，易受环境有害气体或颗粒影响而急性发作，气道、肺实质等发生炎症病变，若不及时有效干预则可能造成肺功能持续下降，导致患者呼吸衰竭而死亡［2-3］。寻找有效治疗手段对COPD急性发作期的治疗有重要意义。COPD中医治疗日渐受到关注［4-5］。研究表明，鱼腥草具有多种潜在药用价值，其提取物中含有多种活性成分且均具有显著的抗炎作用，与地塞米松抗炎能力相近［6］。目前，鱼腥草多用于辅助治疗支原体肺炎、支气管哮喘等肺部炎症性疾病［7］，但关于其对COPD急性加重期炎症抑制作用及呼吸功能的影响报道较少。本研究观察鱼腥草提取物对COPD急性加重期大鼠模型肺功能的影响，并探讨其抗炎机制，以期指导临床用药。

1 材料

1.1 动物SPF级雄性健康Wistar大鼠50只，6周龄，体质量180～220 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号：SCXK（京）2017-0007，饲养于12 h／12 h明暗交替，23～25℃，40%～50%湿度下，所有动物实验操作符合动物伦理学要求。

1.2 药物与试剂鱼腥草（北京同仁堂股份有限公司），100 g鱼腥草加入3倍体积蒸馏水煎煮两次，合并两次煎煮液，蒸发浓缩至100 mL，有效含量为1 000 g·L-1，使用前用蒸馏水稀释至相应浓度。肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）ELISA试剂盒（美国 R＆D Systems公 司，批 号 分 别 为：ML1421、M6000B、MLB00C）；兔抗大鼠Toll样受体4（toll-like receptor 4，TLR4）、核转录因子κB（nuclear factorκB，NF-κB）多抗、山羊抗兔单抗（美国Invitrogen公司，货号分别为：48-2300、46-2725、41-3850）；

1.3 仪器AniRes2005型实验用小动物肺功能测定仪（北京贝兰博科技有限公司）；QuantStudio 3型实时荧光定量PCR仪（美国ABI公司）；CheniDoc XRS型化学发光成像分析仪（美国Bio-rad公司）。

2 方法

2.1 分组与模型建立取50只大鼠，按照体质量排序法随机分为5组：对照组、COPD组、鱼腥草低剂量（1.25 g·kg-1）组、鱼腥草中剂量（2.50 g·kg-1）组、鱼腥草高剂量（5.00 g·kg-1）组，各10只。首先采用烟熏联合气道内滴注内毒素法建立COPD稳定期模型，在此基础上鼻腔内滴菌法建立COPD急性加重期模型［8］，具体操作方法为：分别于实验第7、14、28天气管内滴入浓度为1 g·L-1的内毒素0.2 mL，于实验第1～28天（第7、14、28天除外）将大鼠放置于容积为72 L的有机玻璃仓内，注入雄狮牌香烟烟雾，维持烟雾浓度5%（V／V），每次30 min，建立COPD稳定期模型；于第29～32天，鼻腔内滴注浓度为2.4×109CFU·mL-1的金黄色葡萄球菌溶液，每次0.3 mL，每天2次，连续4 d。大鼠表现为呼吸喘促，动则加剧，鼻部潮湿，打喷嚏及体温升高等体征则判定为COPD急性加重期模型建立成功。

2.2 给药方法除对照组外，造模大鼠建立COPD急性加重期模型过程中因气管插管、麻醉等原因分别死亡2、2、1、1只，其余均建模成功，参与后续实验研究。对照组大鼠气逍和鼻腔内每次滴注等体积生理盐水。根据动物与人体间的等效剂量换算［9］，计算大鼠给药剂量。所有大鼠每天灌胃1次，连续灌胃4周。

2.3 肺功能指标测定末次灌胃后2 h，各组大鼠用12%的乌拉坦腹腔麻醉，仰卧位固定于实验小动物肺功能测定仪的密闭体积扫描箱内，大鼠颈部备皮，纵向切开皮肤暴露气管，于第3～4气管环中间切倒T型切口，插入气管插管，插管连接三通开关，一端连接动物呼吸机，先描记一段平静呼吸，然后由呼吸机输入4～6倍潮气量模拟用力吸气过程，测定用力肺 活量（forced vital capacity，FVC），再 由25 cm H2O负压系统模拟用力呼气过程，记录由胸廓起伏造成容积变化，通过压力换能器和放大器信号处理系统计算肺功能各项指标，包括用力呼气峰流速（peak expiratory flow rate，PEF）、第0.3秒用力呼气容积（forced expiratory volume at 0.3 second，FEV0.3）／FVC、最大呼气中期流速（maximum middle expiratory flow rate，MMEF）［10］。

2.4 肺泡灌洗液（alveolar lavage fluid，BALF）中炎症因子水平检测肺功能指标测定结束后，处死各组大鼠，于气管切口处插入气管套管，用1 mL磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）反复灌洗3次，收集BALF，2 800 r·min-1离心10 min（离心半径为10 cm），取上清液，采用酶联免疫吸附法检测BALF中TNF-α、IL-6、IL-1β水平，按照试剂盒说明书执行操作。

2.5 肺组织病理学观察收集BALF完成后立即打开大鼠胸腔，取部分右肺组织，置于4%中性甲醛中固定48 h，然后经酒精脱水、石蜡包埋，修整后，采用切片机制备厚度为4μm的切片，切片进行常规苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色，显微镜下观察肺组织病理改变。

2.6 检测肺组织中TLR4 mRNA、NF-κB mRNA表达取新鲜右肺组织70 mg，用组织剪剪碎，按照Trizol法提取肺组织中的总RNA，然后逆转录获得互补链cDNA，以之为模板进行实时荧光定量聚合酶链反应，按照试剂盒设定反应体系，反应条件为95℃，5 min；94℃，30 s，56℃，30 s，72℃，60 s；重复40个循环，72℃延伸5 min。用β-actin基因为内参对照，计算TLR4、NF-κB相对表达强度（2-△△CT）［11］。引物序列：TLR4：F：5′-ACGTGATGCTGTTAACCGT-3′，R：5′-TAGTCGTGAACGTGCGTAC-3′；NF-κB：F：5′-CATCAAGCGTACGTGCGTA-3′，R：5′-CTGATGCGTCTGAGATCTA-3′；β-actin：F：5′-TAACGCCGATGCAATGTCT-3′，R：5′-CATGTGGAACTCTGTGCTC-3′。

2.7 检测肺组织中TLR4、NF-κB蛋白表达取新鲜右肺组织70 mg于EP管中，加入细胞裂解液500μL，置于冰上裂解20 min，4℃、12 000 r·min-1离心15 min（离心半径10 cm），取上清液，BCA蛋白定量后，进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰氨凝胶电泳，电泳后转膜2.5 h，经封闭液封闭，按比例稀释一抗4℃摇床孵育过夜，按比例稀释二抗常温孵育2 h后进行曝光和显影，扫描拍照后，应用BandScan软件进行灰度值分析，相对表达强度用TLR4、NF-κB与内参β-actin灰度值的比值表示。

2.8 统计学方法采用SPSS 19.0统计学软件分析数据，计量资料均用均数±标准差（±s）表示，多样本组间比较采用单因素方差分析，两两样本比较采用SNK-q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 大鼠建模情况及一般体征观察对照组大鼠营养状态、饮食、体温等均正常，实验过程中均未死亡。各造模组大鼠COPD稳定期出现皮毛暗淡、蜷缩少动、呼吸喘促、动则加剧现象，经鼻反复滴注菌液期间上述现象更为严重，逐步出现鼻部潮湿、打喷嚏、体温升高等现象，给药后上述症状得以好转。COPD组、鱼腥草（低、中、高剂量）组模型制备成功分别有8、8、9、9只大鼠，参与后续实验。

3.2 对肺功能指标的影响与对照组比较，COPD组、鱼腥草（低、中、高剂量）组上述肺功能指标均降低（P＜0.05）；与COPD组比较，鱼腥草（低、中、高剂量）组上述肺功能指标均升高（P＜0.05），其中鱼腥草高剂量组高于鱼腥草低、中剂量组（P＜0.05），鱼腥草低剂量组与鱼腥草中剂量组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

3.3 对BALF中TNF-α、IL-6、IL-1β水平的影响与对照组比较，COPD组、鱼腥草（低、中、高剂量）组大鼠BALF中TNF-α、IL-6、IL-1β水平均升高（P＜0.05）；与COPD组比较，鱼腥草（低、中、高剂量）组上述上述炎症因子水平均降低（P＜0.05），其中鱼腥草高剂量组低于鱼腥草低、中剂量组，鱼腥草中剂量组低于低剂量组（P＜0.05）。见 表2。

表1 肺功能指标比较 （±s）

注：与对照组比较，a P＜0.05；与COPD组比较，b P＜0.05；与鱼腥草低剂量组比较，c P＜0.05；与鱼腥草中剂量组比较，d P＜0.05

组别n FVC（V／mL）PEF／mL·s-1 FEV0.3／FVC／%MMEF／mL·s-1.05±2.01 COPD组8 5.50±0.53a 29.82±3.02a 67.23±4.02a 16.64±1.12a鱼腥草低剂量组8 6.08±0.51ab 36.30±4.37ab 73.65±4.19ab 18.32±1.43ab鱼腥草中剂量组9 6.29±0.54ab 39.14±5.24ab 74.09±4.25ab 19.15±2.54ab鱼腥草高剂量组9 7.18±0.59abcd 50.36±3.94abcd 78.11±5.07abcd 22.30±2.62abcd F值20.238 62.955 10.949 15.261 P值对照组10 7.71±0.72 57.61±4.45 80.45±5.24 23＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

表2 BALF中TNF-α、IL-6、IL-1β水平的影响 （±s，ng·L-1）

表2 BALF中TNF-α、IL-6、IL-1β水平的影响 （±s，ng·L-1）

注：与对照组比较，a P＜0.05；与COPD组比较，b P＜0.05；与鱼腥草低剂量组比较，c P＜0.05；与鱼腥草中剂量组比较，d P＜0.05

组别n TNF-αIL-6 IL-1 β 10 38.14±4.03 40.75±6.10 28.97±4.26 COPD组8 65.47±5.29a 131.88±12.23a 85.36±6.78a鱼腥草低剂量组8 52.11±5.22ab 104.45±11.15ab 70.12±6.04ab鱼腥草中剂量组9 46.80±4.08abc 81.11±10.10abc 61.47±6.15abc鱼腥草高剂量组9 42.37±4.14abcd 70.92±9.13abcd 52.53±5.38abcd对照组F值46.664 109.600 122.141 P值＜0.001＜0.001＜0.001

3.4 肺组织病理观察HE染色结果显示，对照组大鼠支气管、支气管黏膜、肺泡等结构基本正常；模型组大量肺泡壁断裂融合为气腔、肺泡间质大量炎性细胞浸润，支气管黏膜上皮可见大量杯状细胞增生，支气管管腔狭窄，气道内大量炎性细胞浸润，肺小动脉管壁增厚，周围炎性细胞浸润；鱼腥草各剂量组大鼠上述病理改变较模型组均有所减轻，肺泡融合范围减小，肺间质、气道及肺小动脉周围炎性细胞浸润程度减轻，其中鱼腥草高剂量组改善最明显，但仍存在少量炎症细胞浸润。见图1。

图1 肺组织病理切片（HE染色，×200）

3.5 对肺组织中TLR4 mRNA、NF-κB mRNA表达的影响与对照组比较，COPD组、鱼腥草（低、中、高剂量）组肺组织中TLR4 mRNA、NF-κB mRNA相对表达量均明显升高（P＜0.05）；与COPD组比较，鱼腥草（低、中、高剂量）组肺组织中TLR4 mRNA、NF-κB mRNA相对表达量均降低（P＜0.05），其中鱼腥草高剂量组低于鱼腥草低中剂量组，鱼腥草中剂量组低于鱼腥草低剂量组（P＜0.05）。见表3。

3.6 对肺组织中TLR4、NF-κB蛋白表达的影响与对照组比较，COPD组、鱼腥草（低、中、高剂量）组肺组织中TLR4、NF-κB蛋白相对表达量均升高（P＜0.05）；与COPD组比较，鱼腥草（低、中、高剂量）组肺组织中TLR4、NF-κB蛋白相对表达量均降低（P＜0.05），其中鱼腥草高剂量组低于鱼腥草低、中剂量组，鱼腥草中剂量组低于鱼腥草低剂量组（P＜0.05）。见表4，图2。

表3 对肺组织中TLR4 mRNA、NF-κB mRNA表达的影响 （±s）

表3 对肺组织中TLR4 mRNA、NF-κB mRNA表达的影响 （±s）

注：与对照组比较，a P＜0.05；与COPD组比较，b P＜0.05；与鱼腥草低剂量组比较，c P＜0.05；与鱼腥草中剂量组比较，d P＜0.05

组别n TLR4 NF-κ B对照组3 0.92±0.12 1.01±0.11 COPD组3 1.87±0.21a 2.15±0.16a鱼腥草低剂量组3 1.54±0.23ab 1.87±0.14ab鱼腥草中剂量组3 1.32±0.10abc 1.64±0.15abc鱼腥草高剂量组3 1.10±0.11abcd 1.30±0.12abcd F值47.910 98.034 P值＜0.001＜0.001

表4 对肺组织中TLR4、NF-κB蛋白表达的影响 （±s）

表4 对肺组织中TLR4、NF-κB蛋白表达的影响 （±s）

注：与对照组比较，a P＜0.05；与COPD组比较，b P＜0.05；与鱼腥草低剂量组比较，c P＜0.05；与鱼腥草中剂量组比较，d P＜0.05

组别n TLR4 NF-κ B对照组3 0.21±0.04 0.30±0.04 COPD组3 1.20±0.10a 1.35±0.11a鱼腥草低剂量组3 0.85±0.07ab 1.17±0.10ab鱼腥草中剂量组3 0.77±0.06abc 1.05±0.08abc鱼腥草高剂量组3 0.40±0.05abcd 0.64±0.07abcd F值312.227 247.215 P值＜0.001＜0.001

图2 肺组织中TLR4、NF-κB的蛋白表达

4 讨论

COPD病程复杂，发病率和死亡率逐年升高，目前已位列世界疾病经济负担第5位，且已成为全球性主要致死病因，亟须寻求有效治疗手段改善疾病预后［12-14］。多种因素均可导致COPD患者气道、肺实质炎症反应进行性加重，抑制肺呼吸功能［15-17］。吸烟、感染是导致COPD发作及加重的主要因素，烟熏联合气道内滴注内毒素法建立COPD大鼠模型已获得广泛认可［18-19］。本研究在该方法基础上经鼻滴入金黄色葡萄球菌以获得COPD急性加重期大鼠模型，大鼠一般体征观察及肺组织病理改变与临床表现一致［20］，可用于实验研究。

肺功能检查是COPD诊疗、预后评价的首要指标，反应肺组织损伤程度。本研究发现，不同浓度鱼腥草干预后，大鼠FVC、PEF、FEV0.3／FVC、MMEF均较COPD组升高，且高剂量组最高，说明鱼腥草提取物可有效改善COPD急性加重期大鼠肺功能；干预后BALF中TNF-α、IL-6、IL-1β水平均降低，且呈剂量依赖性；病理观察显示肺泡融合范围减小，肺间质、气道及肺小动脉周围炎性细胞浸润程度减轻，说明鱼腥草提取物可有效减轻COPD急性加重期大鼠肺病理损伤。药理学研究表明，鱼腥草水煎液具体显著的体外抑菌作用，可能通过抑制细菌生物被膜发挥抗菌作用［21-22］。体内实验发现［23］，鱼腥草提取物可有效改善支原体肺炎小鼠肺组织病理变化，降低血清γ-干扰素、IL-6水平，与本研究结果相符，证实鱼腥草有显著抗炎作用，推测鱼腥草提取物通过抑制气道、肺实质内的炎症反应，达到改善肺功能的作用。

TLR4属于天然免疫受体Toll样受体家族成员之一，可通过直接结合病原体或其产物的特定分子结构，引发一系列的信号转导，促进炎症介质释放［24-27］。NF-κB是TLR4下游信号通路，TLR4可通过髓样分化因子88依赖和非依赖两种途径激活NF-κB信号通路，从而发挥调节炎症介质合成和释放的作用［28-31］。本研究发现，应用不同浓度鱼腥草提取物干预后肺组织中TLR4 mRNA、NF-κB mRNA和蛋白相对表达量均较COPD组降低，其中鱼腥草高剂量组降低最显著，提示鱼腥草提取物可能通过抑制TLR4／NF-κB信号通路，调节TNF-α、IL-6、IL-1β炎症因子水平，从而发挥改善COPD急性加重期大鼠肺功能，减轻肺病理损伤的作用。

综上所述，鱼腥草提取物可有效改善COPD急性加重期大鼠肺功能，减轻肺病理损伤，推测与抑制TLR4／NF-κB信号通路有关。在进一步的研究中，应重点探讨鱼腥草提取物能否通过其他信号通路发挥相应调控作用，为鱼腥草相关药物的研发和临床应用提供更全面、充分的理论支持。