●梁啸天 罗 蕊 赵志强 包春光 贾崇宁 霍玉淼 任文静 袁朴芳 高 昶 黄凤兰,4,5,6,7,8※※

（1.内蒙古民族大学生命科学与食品学院 内蒙古 通辽 028000；2.内蒙古民族大学农学院 内蒙古 通辽028000；3.通辽市农畜产品质量安全中心 内蒙古 通辽 028000；4.蓖麻育种国家民委重点实验室 内蒙古 通辽 028000；5.内蒙古自治区高校蓖麻产业工程技术研究中心 内蒙古 通辽 028000；6.内蒙古自治区蓖麻育种重点实验室 内蒙古 通辽 028000；7.内蒙古自治区蓖麻产业协同创新中心 内蒙古 通辽 028000；8.蓖麻产业技术创新内蒙古自治区工程研究中心 内蒙古 通辽 028000）

蓖麻（Ricinus communisL.）是世界上重要的非食用油料植物，含油率高达60%左右，被誉为“可再生的石油资源”[1]，因其具有特色经济价值而广受重视[2]。据报道，土壤被重金属污染后，蓖麻仍可正常生长，表明蓖麻是一种对重金属抗性较强的植物，具有修复重金属污染土地的功能。有学者对铜矿区周围生长的野生蓖麻进行研究，发现蓖麻不仅能够在铜矿区正常生长，还能够在植株内部富集Cu2+，表现出较强的重金属抗性[3]。

近年来，土壤重金属污染现象日益严重，主要重金属污染物包括汞、镉、铅、铜、铬、砷、镍等[4]，对土壤危害较大，其无法被土壤中的微生物分解，导致更多的重金属离子在土壤中累积而转化为危害更大的化合物。部分重金属会通过食物链进入人体，严重危害人类身体健康。研究发现，通过植物的吸收、根滤、稳定可以降低土壤重金属污染程度，具有一定的土壤修复作用[5]。铜是植物生长发育必需的微量元素，参与植物体内多种氧化酶的组成及氧化还原反应，适量的铜能够对植物生长起到促进作用，过量的铜则会导致植物叶片枯黄进而抑制其光合作用，甚至阻碍植物对其他元素的吸收[6]。

目前，众多学者研究了水稻和小麦对Cu2+胁迫的耐受性，也有关于蓖麻对镉胁迫以及铅、锌复合胁迫的耐受性研究，但未见关于蓖麻对Cu2+胁迫的耐受性研究[7-9]。因此本实验选择不同浓度CuSO4溶液对蓖麻进行处理，研究蓖麻种子萌发和幼苗生长对重金属Cu2+的胁迫响应，以期验证蓖麻作为特色经济植物在应对重金属污染土壤修复问题的应用可行性以及适用条件。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 植物材料本实验所用的植物材料为2129 品系蓖麻种子，由内蒙古民族大学内蒙古自治区高校蓖麻产业工程技术研究中心提供。

1.1.2 试剂材料液氮、 愈创木酚、30%H2O2、五水硫酸铜（CuSO4·5H2O）、20%三氯乙酸（TCA）、0.5%硫代巴比妥酸（TBA）、磷酸盐缓冲液（PBS，pH=7.8，50mM）、还原性辅酶II（NADPH）、谷胱甘肽（GSSG）。

1.1.3 其他材料蛭石、土。

1.2 仪器设备

万用电炉（DL-1），电子天平（Satirius BSA224S-CW），高速大容量低温离心机（Thermo MULTIFUGE X3R），小型高速低温离心机（Eppendorf Centrifuge 5424 R），HVE-50 型高温高压灭菌锅（日本），-80℃超低温冷冻冰箱（Thermo Scientific Forma 702），酶标仪（Iinfinite M200 pro），电脑（Lenovo）。

1.3 实验设计

选用饱满度一致的蓖麻种子1 200 粒，共设置12 组培养方案，对照组使用清水，另外11 组处理组分别使用Cu2+浓度为120mg/L、240mg/L、360mg/L、480mg/L、600mg/L、720mg/L、840mg/L、960mg/L、1 080mg/L、1 200mg/L、1 320mg/L的CuSO4溶液，放在25 ℃有光照的温室中培养72h[10]。

当蓖麻生长到四叶期时，选取植株高度、叶片大小一致的20 盆幼苗分别设置为10 个对照组和10 个处理组。对照组幼苗生长期间每次浇1 L 清水，处理组幼苗生长期间每次浇Cu2+浓度为840mg/L（当Cu2+浓 度 为840mg/L 时， 蓖 麻既不受严重抑制也不受促进生长，视其为临界值）的CuSO4溶液1L。分别在7d、15d、21d 拍摄植株整体、叶及根的照片，对比处理组与对照组的区别[11]。

1.4 测定指标和方法

1.4.1 测定指标不同处理组环境下测定蓖麻种子萌发率、根形态（根长、根粗）、种子生理指标[MDA（丙二醛）含量、POD（过氧化物酶）活性、CAT（过氧化氢酶）活性、GR（谷胱甘肽还原酶）活性]、幼苗生理指标(同种子生理指标)。

1.4.2 测定方法

1.4.2.1 种子萌发率统计不同处理组的种子萌发个数与未萌发个数，计算种子萌发率，公式：

1.4.2.2 根形态使用游标卡尺测量不同处理已萌发蓖麻种子的15 个根长数据与5 个根粗数据并记录[13]。

1.4.2.3 蓖麻萌发种子生理指标通过对蓖麻种子萌发率的计算以及萌发种子根长根粗的测量，确定2129 品系蓖麻种子对重金属Cu2+浓度的最大抗性值，按以下方法测定最大抗性浓度萌发种子的MDA 含量、POD 活性、CAT 活性、GR 活性。蓖麻萌发种子预处理。将不同处理下的萌发种子置于预冷的研钵中，倒入液氮研磨成干粉，以每份0.4g 分装于15mL 离心管内，加入4mL 的PBS，用摇床摇10min，混成匀浆后在6℃、6 000 rpm下离心10min，留取上清液即获得酶粗提液。将上清液每份1mL 分装于1.5mL 离心管内，-80℃超低温冰箱保存备用。

MDA 的测定方法。吸取1mL 上清液置于玻璃试管中并加入2mL 0.5% TBA 沸水浴15min，然后进行冰上冷却，冷却后吸取1mL 置于1.5mL 离心管内，10 000rpm 下离心10min。取200μL 上清液测定OD450、OD532、OD600。对照组以PBS 代替酶液调零。

MDA 浓度和含量的计算公式：

其中，V1为提取液总体积（4mL）；V2为测定用酶液体积（1mL）；W 为样品鲜重（0.4g）[15]。

POD 的测定。取50mL PBS 置于烧杯中，加入28μL 愈创木酚搅拌，直至愈创木酚溶解，再加入19μL 30%的H2O2，混匀后置于水浴锅中34℃加热10min。避光保存于4℃冰箱中备用。取2mL 混合液并加入20μL 酶液，测定OD470值3min 内的变化。对照组以PBS 代替酶液调零。以每分钟OD 值变化（升高）1 为1 个酶活性单位（U）。按下式计算活性：

其中，ΔOD470为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重（0.4g）；t为反应时间（3min）；V1为提取酶液总体积（4mL）；V2为测定时取用酶液体积（0.02mL）[16]。

CAT 的测定。4mL 离心管中各加入1.5mL 的PBS、1mL 蒸馏水，置于水浴锅中25℃预热5min，向每个离心管中加入0.3mL H2O2（0.1mol/L），混匀后备用。每管再加入200μL 酶液，测定OD240值3min 内的变化。对照组以PBS 代替酶液调零。以每分钟OD值变化（减小）0.1 为1 个酶活性单位（U）。按下式计算活性：

其中，ΔOD240为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重（0.4g）；t为反应时间（3min）；V1为提取酶液总体积（4mL）；V2为测定时取用酶液体积（0.2mL）[17]。

GR 的测定。4mL 离心管中各加入1 550μL 的PBS、140μL 的NADPH，260μL 的GSSG，混 匀后备用。每个离心管中加入300μL 酶液，测定OD340值2min 内的变化。对照组以PBS 代替酶液调零。

在一定温度下，每克样本每分钟催化1μmol NADPH 氧化为1 个酶活单位（U）。按下式计算活性：其中，ΔOD340为处理组反应时间内吸光度的变化；ΔOD对照为对照组反应时间内吸光度的变化；ε为NADPH 摩尔消光系数6.22×103L·mol/cm；d为比色皿内径（5.85mm）；W为样品鲜重（0.4g）；t为反应时间（2min）；V1为提取酶液总体积（4mL）；V3为反应体系总体积（2.25mL）；V2为测定时取用酶液体积（0.3mL）[18]。

1.4.2.4 蓖麻幼苗生长指标测定测定处理组与对照组蓖麻幼苗的MDA 含量、POD 活性、CAT活性、GR 活性四项生理指标。测定方法同种子生理指标测定方法[15-18]。

2 结果与分析

2.1 蓖麻种子萌发对重金属Cu2+的胁迫响应

2.1.1 蓖麻种子萌发率使用浓度为0mg/L、120mg/L、240mg/L、360mg/L、480mg/L、600mg/L、720mg/L、840mg/L、960mg/L、1 080mg/L、1 200mg/L、1 320 mg/L 的CuSO4溶液分别处理蓖麻种子。蓖麻种子萌发率比较结果，见表1。

表1 种子萌发率比较结果

由表1 可知，虽然组间显著性差异明显，但Cu2+浓度的高低对2129 品系蓖麻种子的萌发率无明显影响规律。

2.1.2 蓖麻萌发种子根的形态学图1 为使用清水组与Cu2+浓度为840mg/L 的CuSO4溶液处理后的蓖麻种子萌发状况，图2 为萌发种子根长测量结果，图3 为萌发种子根粗测量结果。

由图1、图2 可知，蓖麻种子的根长对Cu2+低浓度与高浓度存在不同的胁迫响应。Cu2+浓度低时，可以促进蓖麻种子根的生长；Cu2+浓度高时，可以抑制蓖麻种子根的生长。由图1、图3可以看出，蓖麻种子根粗的生长受Cu2+的胁迫效应不明显。

2.1.3 蓖麻萌发种子的生理指标使用浓度为0mg/L、840mg/L 的CuSO4溶液分别处理蓖麻种子后，处理组与对照组各项生理指标测定结果，见图4。

由图4 可以看出，用Cu2+浓度为840mg/L 处理的蓖麻种子萌发后，处理组MDA 含量和CAT活性明显高于对照组，但POD 活性和GR 活性明显低于对照组。

2.2 蓖麻幼苗生长对重金属Cu2+的胁迫响应

2.2.1 蓖麻幼苗形态学统计清水对照组与Cu2+浓度为840mg/L 处理组各10 盆（每盆1 株），当蓖麻幼苗长到四叶期的时候分别使用Cu2+浓度为840mg/L 的CuSO4 溶液及清水对两组幼苗进行浇灌。图5、图6、图7 分别为处理7d、15d、21d后的蓖麻幼苗生长状况。其中，A 为植株对比照片，左为处理，右为对照（CK）；B 为叶片对比照片，左为处理，右为对照（CK）；C 为根部对比照片，左为处理，右为对照（CK）。

由图5、图6、图7 可以看出，随着处理时间的增加，处理组蓖麻植株高度逐渐矮于对照组，处理组根量明显少于对照组，处理组叶脉褪绿逐渐加深。

2.2.2 蓖麻幼苗四叶期叶片生理指标清水对照组与Cu2+浓度为840mg/L 处理组各10 盆（每盆1株），当蓖麻幼苗长到四叶期的时候，使用浓度为840mg/L 的CuSO 溶液及清水对两组幼苗进行浇灌。图8 为蓖麻叶片的生理指标测定结果。

由图8 可知，当使用Cu2+浓度为840mg/L的 CuSO4溶液浇灌蓖麻21d 后，随着处理时间的增加，对照组MDA 含量同处理组相比，对照组MDA 含量在7d 至15d 升高，在15d 至21d 下降；处理组MDA 含量在7d 至15d 升高，在15d至21d 降低，但变化趋势不如对照组明显。对照组POD 活性同处理组相比，其变化趋势大致相同，对照组与处理组P OD 活性在7d 至15d内大幅度降低，在15d 至21d 略微升高，但处理组POD 活性升高趋势较对照组明显。对照组CAT 活性同处理组相比，对照组CAT 活性在7d 至15d 内明显降低，在15d 至21d 明 显升高；处理组CAT 活性在7d 至15d 内明显升高，在15d 至21d 略微降低。对照组GR 活性同处理组相比，其变化趋势有明显不同，对照组GR 活性在7d 至15d 明显降低，在15d 至21d 明 显升高；处理组GR 活性在7d 至15d 内明显升高，在15d 至21d 明显降低。蓖麻种子在Cu2+浓度为1 320mg/L 时仍未死亡，表明蓖麻种子对Cu2+具有很强的耐受性；蓖麻幼苗在Cu2+浓度为840mg/L 时处理至21d 仍未死亡，证明蓖麻幼苗对Cu2+也有很强的耐受性。

3 结果与分析

3.1 重金属Cu2+对蓖麻种子萌发的影响

蓖麻种子萌发的过程需要大量的物质与能量，储存在种子中的有机物在种子萌发时会转化成容易被胚吸收的形态，从而为种子萌发提供能量[19]，在其萌发阶段，受外界因素影响较大，当使用重金属Cu2+对其进行胁迫时，蓖麻种子的萌发受到影响，Cu2+通过抑制蓖麻种子内酶的活性，从而抑制蓖麻种子内有机物的转化，使蓖麻种子萌发受到抑制。此次种子萌发率实验在设计时未考虑到三次重复，因此在经过Cu2+浓度为840mg/L的CuSO4溶液处理蓖麻种子后，虽然在组间表现出差异性显著却未能表现出重金属Cu2+对蓖麻种子萌发率的影响规律，但在测量其根长时却发现不同Cu2+浓度处理组萌发种子的根长与对照组相比有明显不同，根据蓖麻萌发的形态学特征和生理指标变化可以判断重金属Cu2+的胁迫可能有：抑制种子内酶的合成，从而抑制种子内有机物的转化。POD 活性、GR 活性显著性减少，可能是重金属Cu2+抑制种子细胞内的过氧化物酶和谷胱甘肽还原酶活性，进而抑制了种子萌发后根的生长。通过查阅文献可知，水稻在Cu2+浓度为6.4mg/L 进行种子萌发处理时会出现种子死亡现象，小麦在Cu2+浓度为32mg/L 进行种子萌发处理时会出现种子死亡现象[20]。通过蓖麻与水稻种子、小麦种子对比，可以看出蓖麻对Cu2+胁迫具有很强的耐受性。

3.2 重金属Cu2+对蓖麻幼苗生长的影响

蓖麻生长过程中会通过叶片进行光合作用，而根系吸收养分为蓖麻生长提供必需能量，因此，蓖麻产量会受其幼苗的生长状态影响[21]。根据蓖麻幼苗的形态学特征和生理指标变化可以判断Cu2+的胁迫可能有：重金属Cu2+污染土壤后，蓖麻根部开始吸附Cu2+并在体内运输，从而导致植株代谢过程紊乱，叶片内叶绿素减少或失去活性，叶脉失绿，光合作用受到影响[22]，其根系吸收营养物质的能力也会有所下降，造成幼苗生长期营养不良。蓖麻幼苗期是受重金属Cu2+胁迫的最显著时期[23]，处理组CAT 活性和GR 活性与对照组相比显著性增加，表明蓖麻的抗逆性增强。Cu2+对蓖麻幼苗生长的胁迫原理可能与胁迫种子的原理相同，通过抑制植株过氧化物酶、过氧化氢酶及谷胱甘肽还原酶的合成，从而抑制植株有机物的转化[24]。因本次盆栽实验中重金属Cu2+浓度虽达到840mg/L 却未出现植株死亡现象，故认为2129 品系蓖麻是有重金属抗性并具有一定重金属积累作用的特色经济作物[25]。通过查阅文献可知，水稻幼苗对Cu2+耐受最大浓度为10mg/L，Cu2+浓度越高，对水稻幼苗生长的抑制作用越大[26]；小麦幼苗对Cu2+耐受最大浓度为100mg/L，Cu2+浓度越高，对小麦幼苗生长的抑制作用越大[27]。通过蓖麻与水稻、小麦幼苗相比，可以看出蓖麻对Cu2+胁迫具有很强的耐受性。

4 结论

蓖麻种子和幼苗对Cu2+的胁迫响应，实验结果如下：种子萌发阶段，萌发率在组间虽表现出明显差异但未表现出明显胁迫规律；根长随Cu2+浓度的增加整体呈现下降的趋势；根粗随浓度的增加无显著变化，但使用Cu2+浓度为840mg/L 的CuSO4溶液对蓖麻种子进行萌发处理时，蓖麻种子对Cu2+表现出最大抗性；Cu2+浓度为840mg/L时，蓖麻萌发根长度最接近平均值，对其进行四项生理指标测定，发现处理组种子MDA 含量和CAT 活性明显高于对照组，但POD 活性和GR 活性明显低于对照组。幼苗生长阶段，用Cu2+浓度为840mg/L 的CuSO4溶液处理后，随处理时间的增加，处理组植株高度逐渐矮于对照组；处理组叶片与对照组相比叶脉明显褪绿；处理组根量明显少于对照组；生理指标方面，处理组和对照组MDA 含量、POD 活性的变化趋势相同，CAT 活性、GR 活性变化趋势相反，MDA 含量、CAT 活性以及GR 活性升至最大值，POD 活性降至最小值。由此可得出结论，蓖麻主要发挥其超累积优势，对重金属实现强有效的解毒及累积，所以蓖麻完全可以为修复重金属污染及环境治理发挥特殊优势。