王丽娟，梁晓磊，杨永秀

1 背景

卵巢癌是威胁女性健康的高度恶性肿瘤，根据世界卫生组织国际癌症研究机构2018年全球肿瘤流行病统计数据显示，2018年全球约有29.5万新发病例，其中约18万死亡。卵巢肿瘤中以上皮性肿瘤最常见，约占50%～70%。年龄、家族史、排卵周期及突变基因(如乳腺癌1/2号基因)等是其重要危险因素。卵巢癌早期往往无明显症状，加之初发症状常常缺乏特异性，与消化系统、泌尿系统症状难以鉴别，因此常规诊疗程序如妇科检查、血清CA125和经阴道超声检查通常不能发现早期卵巢癌[1]，超过一半的患者确诊时已是晚期并已发生转移[2]，5年生存率仅有20%～25%[3-4]，而对于能早期诊断的患者，5年生存率可达90%[5]。现阶段卵巢癌标准治疗手段是肿瘤细胞减灭术加铂类等化疗药的综合治疗，尽管完全缓解率高达60%～80%，但仍有近50%的患者后期会出现化疗耐药或复发[6]。卵巢癌的转移与化疗耐药是当前卵巢癌治疗面临的重要困难。因此，明确卵巢癌发生发展、转移、耐药的特有机制，发现对应的有效靶点是当前卵巢癌研究所必须解决的。

肿瘤内异质性(intratumoral heterogeneity，ITH)是指肿瘤中含有表型各不相同的细胞亚克隆，从而在细胞增殖、侵袭、转移能力及治疗反应等方面表现不同[7]。癌症在癌细胞及其微环境的相互作用下动态发展，异质性也在这个过程中逐步形成。有人认为遗传不稳定性是肿瘤发展中产生异质性的基础，早在1958年，进化生物学家Huxley就已经提出了癌症中“遗传不均一性”的观点[8]。由外源性刺激(如烟雾或紫外线等)和内源性染色体畸变推动肿瘤进展，使得癌细胞发生遗传与表型变异，衍生ITH，癌细胞带着不同的分子特征，对抗癌治疗表现出不同的敏感性，进而在治疗过程中出现耐药[9]。如果说遗传不稳定是ITH的启动剂，那么克隆进化学说就是维持剂，这一学说最早在1976年由Peter Nowell提出[10]，不断扩大的肿瘤细胞群在遗传变异的作用下产生多个亚克隆，进一步通过克隆进化实现发展增殖，在实体肿瘤中多采用分支进化模式，由一个共同祖先产生多个亚克隆进化；而在部分血液肿瘤中则发生线性进化，通过连续突变促进有生存优势的进化[11](见图1,彩插1)。

ITH的出现可能使从单个肿瘤活检样本中描绘的基因组图谱变得局限，同时对疾病生物标志物的开发和对患者个体治疗方案的制定提出重大挑战。在精准医疗的大背景下，我们需要以个体为基础，利用当代网络大数据资源对个体的所有生物学特性、环境因素、疾病相关因素进行有机整合，准确判断个体肿瘤发展状态，制定真正的个体化治疗方案。

2 卵巢癌肿瘤内异质性的分子机制

利用基因组测序的手段发现生物体内主要是体细胞突变及拷贝数变异导致了肿瘤内表型的多样性。Nakamura K等[12]选取1例67岁高级别浆液性卵巢癌患者，对3个肿瘤区域中约160个与癌症相关的基因突变进行研究，在病理切片中发现从区域a到区域c细胞核异性程度增加，测序结果显示在区域b和c中ERBB2扩增，拷贝数(CN)=32(b)、26(c)，而在区域a中ERBB2仅轻微扩增(CN=6)；在区域c中检测到KRAS扩增(CN=4)，但在区域a和b中未检测到。在3个不同区域中观察到了体细胞突变的差异及拷贝数的变异，再一次提示这种肿瘤进化出的亚克隆是阻碍靶向治疗的拦路石。对于高级别浆液性卵巢癌，最普遍的遗传特征是TP53突变，但是在肿瘤发展中，该基因亦存在错义突变，发展出无P53表达的亚组，并有研究发现，相比于其他TP53突变的亚型，这类肿瘤预后更差[13]。为进一步明确无P53卵巢癌的ITH，Alba等[14]选取来自同一患者的6个原发灶、2个盆腔内复发灶和4个盆腔外复发灶样本进行全外显子测序，结果显示发现的102个基因突变中只有42个在所有样本中共有；存在拷贝数变异的18个基因也仅有7个在所有样本中检测到，同时研究者也发现了其中与卵巢癌复发最具相关性的基因，如GPNMB、TFDP1。

除了最常见的高级别浆液性卵巢癌，在一些特殊类型卵巢癌中亦发现具有典型的时间(原发灶与转移灶之间的差异)和/或空间(瘤灶内部差异)异质性。Arnaud等[15]研究发现成人型卵巢颗粒细胞瘤是一种罕见的卵巢癌，其潜伏期长，复发率高，在对原发灶和配对复发灶行sanger测序后发现，在复发灶中TP53、TET2、MED12等基因发生突变，表示了与疾病进展和复发的相关性。在一项关于卵巢透明细胞癌的研究中，研究者选取6例患者，每个样本选取4个区域进行全基因组测序，共发现七千多个体细胞突变，112个拷贝数变异，作者指出这种基因突变驱动的ITH对肿瘤的分子检测和靶向治疗具有重要意义[16]。随着测序技术的持续发展，越来越多的研究利用全外显子测序、单细胞测序、T细胞受体测序等手段对ITH进行探究[17-19]，不仅揭示了肿瘤内不同区域的克隆进化，更阐明了异质性发生的分子机制，指出重要突变和拷贝数变异作为潜在治疗靶标的重要性。

3 卵巢癌肿瘤内异质性的系统进化与量化

肿瘤多区域测序的发展，使靶向治疗逐渐进入临床医生的视野，但在治疗过程中出现的耐药性又日益凸显出疾病进化研究的重要性，提示需要进一步研究实现对疾病发展的预测。Thomas等[20]提出以多区域测序结果为基础，构建“系统发育树”可以较好地表示患者肿瘤的进化过程，即在肿瘤发展过程中，癌细胞的进化并不是遵循顺序或线性规律，而是将每个新产生的突变作为一个分支，最终形成树状结构，随后，可以通过统计数据对ITH进行量化，例如总平均树长，即从树根到叶节点的平均突变数，表示为与样本数无关的平均突变负担。在Lee等[21]的研究中就应用了“系统发育树”，研究标本取自1例71岁的IIIC期卵巢癌患者，共包括7个肿瘤样本、3个转移样本，利用全外显子测序数据构建“系统发育树”，形成两个原发肿瘤簇(P1、P2)和一个转移簇(M)，分析比较后发现P1、P2簇在肿瘤发育早期就发生了分化，而M簇中的基因结构与P1簇相似，具有较少的基因突变和拷贝数变异，从“系统发育树”中发现除了亚克隆进化，肿瘤微环境也可能通过分泌一些诱导因子促进肿瘤的生长与转移。有一种观点认为输卵管病变是卵巢癌的前体病变[22]，为明确疾病顺序，Jeremy等[23]利用4例患者的9个不同区域进行二代测序以分析单核苷酸变异，构建卵巢肿瘤和腹腔转移肿瘤的“系统发育树”，量化突变分支与树根距离后发现，转移分化发生于早期，且与原发肿瘤突变相似，进一步证明卵巢癌起源于输卵管病变的观点。

为明确肿瘤内亚克隆导致的异质性是否与患者预后相关，Schwarz等[24]开发了用于肿瘤内拷贝数比较的最小事件距离算法对ITH的系统进化进行定量分析，共纳入14例接受铂类药物治疗患者的135个样本进行全基因组测序，量化结果用肿瘤间克隆扩增程度(clonal expansion，CE)表示，以中位数0.74将样本分为高CE组和低CE组，比较后发现每位患者均表现出很高的异质性，同时观察到CE值与患者预后相关，即与低CE组相比高CE组生存期较短(总生存期：12.7月vs 42.6月；无进展生存期：10.1月vs 23.5月)。综上可见，“系统发育树”可以较准确地描绘肿瘤的进化轨迹，结合“系统发育树”的量化可以作为肿瘤的预后指标。

4 卵巢癌肿瘤异质性的临床意义

最具治疗前景的分子靶向疗法是基于单一样本的基因组图谱分析，找出疾病发生的关键基因将其视为癌症驱动因子，针对关键基因进行的靶向治疗，但是研究发现，尽管初期治疗反应良好，后期几乎所有癌症都会对靶向药物产生耐药[25-27]。耐药性是患者长期生存的一大威胁，同时也是医生进行治疗的一大难题，这主要是ITH造成的，如果对异质性进行更深入的研究，或许能克服这一困难，同时开发异质性在肿瘤诊断及治疗方面的作用，可为卵巢癌患者带来福音。在Takaya等[28]的研究中揭示了异质性与卵巢癌预后的关系，通过TCGA数据库纳入502例基因芯片数据，利用克隆指数(cloning index，CI)和杂合性缺失(loss of heterozygosity，LOH)得分对异质性量化，将病例分为4组：高CI/高LOH组、高CI/低LOH组、低CI/低LOH组、低CI/高LOH组，无进展生存期分别为：16.8月、16.6月、15.0月、22.6月；总生存期分别为：49.5月、38.6月、38.6月、55.1月，其中低CI/高LOH组预后最佳，由此可见ITH与卵巢癌预后显著相关，有望利用ITH量化手段构建预后预测模型，指导临床治疗。在诊断方面，Choi等[29]对卵巢癌样本和腹水癌细胞的全外显子测序分析后首次发现腹水癌细胞通过整合ITH可以重建整个卵巢癌的基因组，由此推断可将其作为发现对卵巢癌具有诊断和治疗意义的体细胞突变的潜在资源。传统靶向治疗产生耐药的机制认为主要是由“系统发育树”中分支亚克隆突变驱动产生的，对于ITH，靶向单个优势克隆或许会破坏各亚克隆间原有的相互作用，研究者认为可以依据“系统发育树”中的突变次序，采取顺序或组合靶向治疗策略，从而有效延长患者生存期[30]。

5 小结

卵巢癌恶性程度高、发现晚、易复发和耐药的特性严重影响患者生理、心理。综合本文所述，ITH在卵巢癌的发生发展中发挥着重要作用，越来越多的研究揭示了异质性与耐药的相关性，同时，更多的证据指出异质性的量化与卵巢癌不良预后有关。因此，明确ITH的发生机制有助于寻找疾病发展的关键驱动因子，结合基因组学研究描绘疾病发展轨迹，是预判后期进展、指导临床治疗的最具潜力的途径。为实现精准医疗，我们需要进一步了解肿瘤内关键驱动基因及其异质性的变化，探索肿瘤进化史，研究异质性与肿瘤微环境的相互作用，寻找促进肿瘤发展的规律，探索顺序或组合靶向治疗手段，为新靶向治疗提供研究基础。