(延边朝鲜族自治州产品质量检验所,延吉 133000)

黑参是五加科植物人参经九蒸九曝、反复蒸干而制成的一种新型人参炮制品。近年来,随着物质生活水平的提高,人们越来越重视健康,人参作为吉林省的地理标志产品,在国内外保健品市场受到广泛关注,许多保健功能食品都以人参为基本原料。根据国内外研究,黑参含有人参皂苷Rg3、人参皂苷Rg5和人参皂苷Rk1等20多种稀有皂苷,还富含多糖、氨基酸、有机酸和酯类、甾醇及其糖苷、含氮化合物、维生素、黄酮类和一些微量元素[1-2]。与传统红参、白参相比,黑参具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗血栓和降血糖等药理作用,能增强免疫力[3]。由于生产加工过程中需要高温,黑参在长期高温加工过程中可能导致苯并芘的产生。

苯并芘又称苯并[α]芘(BaP),属多环芳烃,是一种高活性的间接致癌物质和突变源。苯并芘可通过吸入、食用、经皮吸收等途径侵入人体,刺激人的眼睛和皮肤,长期接触可能会导致DNA 受损和细胞癌变[4]。目前,在苯并芘的含量测定中,大多采用气相色谱-质谱法[5]、液相色谱-质谱法[6]、液相色谱-荧光检测法等[7-10]。本工作基于现行国家标准GB 5009.27-2016《食品安全国家标准食品中苯并芘的测定》,进一步优化试验条件,采用超声波萃取-反相高效液相色谱-荧光法测定黑参中苯并芘的含量,该方法简单、高效、快速,以期为今后黑参加工生产中产生的苯并芘的质量控制提供技术支撑。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1260型高效液相色谱仪,配荧光检测器;RE-52型旋转蒸发仪;苯并芘分子印迹固相萃取柱(1 000 mg/6 mL)。

苯并芘标准储备溶液:100 mg·L-1,称取苯并芘标准品5 mg,置于50 mL棕色容量瓶中,加入适量乙腈超声溶解后,用乙腈定容,配制成100 mg·L-1的标准储备溶液,于0～4 ℃避光保存。

苯并芘标准溶液:1 mg·L-1,移取苯并芘标准储备溶液1.0 mL,置于100 mL棕色容量瓶中,用乙腈定容,配制成1 mg·L-1的标准溶液。

苯并芘对照品,纯度大于99%;黑参为实验室送检样品;正己烷、二氯甲烷为分析纯;乙腈为色谱纯;试验用水为一级水。

1.2 色谱条件

Agilent TC-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm);柱温35 ℃;流量1.0 mL·min-1;进样量10μL;流动相为88%(体积分数,下同)乙腈溶液;激发波长365 nm,发射波长410 nm。

1.3 试验方法

称取粉碎混合后的黑参样品0.500 0 g,置于50 mL离心管中,加入5 mL 正己烷,漩涡混合0.5 min,于40℃超声提取0.5 h,以3 500 r·min-1的转速离心5 min,收集上清液,用同样的方法再次提取残渣,合并提取液。依次用二氯甲烷5 mL、正己烷5 mL活化苯并芘分子印迹固相萃取柱,将上述待纯化液移至固相萃取柱中,当液位降至柱床时,用正己烷8 mL淋洗,弃去淋洗液,然后用二氯甲烷8 mL洗脱,洗脱液收集在鸡心瓶中,于38℃减压蒸除溶剂。加入乙腈1 mL,漩涡溶解0.5 min,经0.22μm 有机滤膜过滤,即得样品溶液,按色谱条件进行测定。另取一只离心管,加入正己烷0.500 0 g,按上述方法处理,制得空白溶液。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的选择

试验主要从样品溶剂、流动相组成、仪器参数设置、进样量等方面选择色谱条件。根据苯并芘的物理性质,可溶于有机溶剂如苯、甲苯、二氯甲烷、三氯甲烷、正己烷、丙酮等,其中正己烷是烷烃,与脂肪酸、脂肪烃和芳香烃均有很好的互溶性,故试验中以正己烷为溶剂从样品中提取苯并芘,并以正己烷作为淋洗剂,淋洗固相萃取柱,可有效地溶解、除去脂肪酸类杂质等,同时鉴于苯、甲苯、三氯甲烷的强烈毒性,选择二氯甲烷作为洗脱剂。

试验考察了90%(体积分数)乙腈溶液、88%乙腈溶液、85%(体积分数)乙腈溶液、80%(体积分数)作为流动相时对样品的分离效果。结果表明,88%乙腈溶液作为流动相时,苯并芘和杂质峰能较好地分离,且保留时间最短。

试验还发现,荧光法测定苯并芘响应信号较高,为保证峰形的清晰度和对称性,试验选择进样量为10μL;用荧光光谱仪扫描苯并芘标准溶液,发现激发波长在365 nm 处有最大吸收峰,发射波长在410 nm 处有最大吸收峰。色谱柱选用的Agilent TC-C18色谱柱为反相柱,所得苯并芘色谱图基线噪声小、漂移小、峰形对称,定性和定量重现性良好,空白溶液吸收值为零,对试验结果无干扰,系统适应性好,专属性强。按上述条件测得的苯并芘标准溶液、样品溶液的色谱图见图1。

2.2 净化柱的选择

根据现行国家标准GB 5009.27-2016中苯并芘的检测方法,苯并芘净化柱包括中性氧化铝固相萃取柱和分子印迹固相萃取柱。试验发现,采用中性氧化铝固相萃取柱时,溶剂消耗量大,试验成本增加,而使用分子印迹固相萃取柱试剂消耗少、净化效果好,在批量样品测定时,操作更加方便、简单,具有一定的优势。因此,试验选择分子印迹固相萃取柱。

图1 苯并芘标准溶液和黑参样品溶液的色谱图Fig.1 Chromatograms of benzopyrene standard solution and black ginseng sample solution

2.3 标准曲线和检出限

分别移取适量的苯并芘标准溶液,用乙腈逐级稀释,配制成0.50,1.0,5.0,10.0,20.0μg·L-1的标准溶液系列,按试验方法进行测定,以苯并芘标准溶液的质量浓度为横坐标,相应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线,外标法定量。结果表明:苯并芘的质量浓度在0.50～20.0μg·L-1内呈线性关系,所得线性回归方程为y＝45.09x-1.140,相关系数为0.999 9。按仪器的3倍的信噪比(S/N)计算方法的检出限(3S/N),结果为0.20μg·kg-1。

2.4 精密度和回收试验

对空白基质进行不同浓度水平下(2.00,10.00,20.00μg·kg-1)的加标回收试验,每个样品按试验方法平行测定6次,外标法定量,所得的回收率和测定值的相对标准偏差(RSD)见表1。

由表1可知:加标回收率为92.8%～97.5%,表明该方法具有良好的准确度。

取10.0μg·L-1苯并芘标准溶液,重复测定6次,记录苯并芘色谱峰峰面积,分别为451.0,449.0,452.8,453.4,451.0,450.6,计算得峰面积的RSD 为0.06%,表明仪器精密度良好,准确度高。

取同一样品溶液,重复测定6次,记录样品峰面积,通过标准曲线计算苯并芘的含量,其测定值的RSD 为1.1%,说明该方法具有良好的重复性。

表1 精密度和回收试验结果(n＝6)Tab.1 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

2.5 样品分析

按试验方法测定编号为HS1～6的6批次黑参样品,结果显示,6批次黑参样品中有1个批次样品检出苯并芘,为1.21μg·kg-1,色谱图见图1(b),其他5批次黑参样品中苯并芘含量均低于检出限。

黑参在加工过程中由于高温条件可能会产生一定量的致癌物质苯并芘,本工作采用超声萃取-反相高效液相色谱-荧光法测定黑参中苯并芘的含量。以正己烷为萃取剂,分子印迹固相萃取柱为净化柱,所得方法的回收率为92.8%～97.5%。该方法具有前处理简单、重现性好、分析时间短、专属性强、灵敏度和检测效率高、检测成本低等优点,适用于黑参中苯并芘的测定。