郝安琦，耿兆楠，孙福亮

延边大学农学院动物医学系，吉林延吉 133000

绿脓杆菌，又名铜绿假单胞菌,是一种革兰氏阴性需氧杆菌，在1882年由Gersard氏从伤口脓液中分离得到。绿脓杆菌在自然界中分布广泛，水、土壤、肠胃内容物中均存在。鸡、鸭、兔、牛、马、羊、鹌鹑、水貂、熊猫等动物均可被感染，不同动物感染绿脓杆菌所表现的病症有差异。研究发现：绿脓杆菌可能导致狐狸流产、子宫化脓[1]；羊慢性化脓性肺炎[2]；水貂出血性肺炎[3]等疾病。牛感染绿脓杆菌多见临床表现为肺炎[4]或腹泻。为了解及确定延边州某养殖场犊牛腹泻病原菌，本文采用了形态学观察、革兰氏染色观察、生化试验、分子生物学鉴定、药敏试验等方法确定了该病原菌为绿脓杆菌。

1 材料

1.1 病料来源

采集于延边州某养殖场腹泻犊牛粪便。

1.2 主要试剂

血琼脂培养基、LB固体培养基、LB液体培养基、生化试验试剂盒、常用抗生素药敏纸片、革兰氏染色剂、琼脂糖、PCR扩增试剂盒。

2 方法

2.1 细菌的分离

粪便稀释后分别涂布于血琼脂平板和普通LB固体平板上，置于37 ℃培养箱内培养12 h后挑取单个菌落划线培养纯化。

2.2 细菌的鉴定

2.2.1 形态学观察

挑取培养基上生长的单个菌落，革兰氏染色后镜下观察其形态特征。

2.2.2 生化试验

糖类发酵试验、氧化酶试验、枸橼酸盐、硝酸盐还原试验、明胶液化试验、尿素水解试验、硫化氢试验、V-P试验和吲哚试验。

2.2.3 分子生物学试验

取典型菌落，进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳试验，提取PCR纯化产物后后送至长春生工公司进行测序。

2.2.4 药敏试验

选取含不同效果抗生素14种药敏纸片进行药敏扩散试验。

3 结果

3.1 形态学观察结果

在LB固体培养基上形成大小不一、扁平、表面粗糙、灰绿色的菌落，血琼脂培养基中出现溶血环，粘稠，有特殊气味；革兰氏染色后显微镜下观察该菌株是革兰氏阴性杆菌，基本呈单个散在分布，部分成对出现。

3.2 生化结果

该菌株分解葡萄糖、木糖、果糖产酸，利用枸橼酸盐，硝酸盐还原产氮气，氧化酶试验、明胶液化试验、尿素水解试验为阳性，硫化氢试验、V-P试验和吲哚试验均为阴性。

3.3 分子生物学结果

根据16s rDNA测序、GenBank数据库比对，该菌株与铜绿假单胞菌菌株SQ-5同源性达到97%。

3.4 药敏试验结果

对庆大霉素、头孢呋辛、头孢噻吩、多粘菌素B敏感，对痢特灵、四环素、红霉素、青霉素、氯霉素、苯唑青霉素、先锋霉素V、链霉素、壮观霉素、诺氟沙星耐药。

4 讨论

绿脓杆菌是一种人畜共患条件性致病菌，该菌致病力较低但抗药性强，广泛分布于环境、土壤等自然界中，动物肠道内和皮肤上也可分离出，可致多种动物感染，脏器肿大，常与葡萄球菌、大肠杆菌等致病菌造成混合感染。不同动物感染绿脓杆菌所表现的病症有差异，狐狸感染绿脓杆菌可能导致流产、子宫化脓；羊感染绿脓杆菌可导致慢性化脓性肺炎，母羊导致流产；水貂导致出血性肺炎等疾病；牛感染绿脓杆菌多见临床表现为肺炎或腹泻。

随着养殖业的规模化发展，抗生素作为饲料添加剂用来预防和控制畜禽的细菌性疾病已经成为主要措施，然而抗生素的不合理使用和滥用导致了动物源耐药细菌大量出现，抗生素曾是治疗细菌感染的有效药物，然而现在因大量使用抗生素，导致许多细菌对抗生素产生耐药性，已无法达到理想的治疗效果，本试验分离出的绿脓杆菌菌株也具有较高的耐药性，在14种药敏纸片的作用下，仅对氨基糖苷类抗生素庆大霉素、头孢菌素类头孢呋辛、头孢噻吩、多肽类抗生素多粘菌素B敏感。如今细菌耐药性逐渐增强，我们应当控制抗生素的使用，避免滥用抗生素出现耐药菌株。

关于绿脓杆菌感染的治疗，庆大霉素、头孢呋辛、头孢噻吩、多粘菌素B可作为治疗绿脓杆菌的首选药物。根据Septama Abdi Wira等人研究报告显示，青蒿素与四环素联合用药对绿脓杆菌有很好的效果，因此也可以从联合用药等方式研究讨论绿脓杆菌的治疗方法。

5 结论

通过本试验对病原菌进行形态学观察、生化分析、16s rDNA测序等方法，确定其为绿脓杆菌，本例牛源绿脓杆菌与铜绿假单胞菌菌株SQ-5同源性极高。