秦青秀,叶丽虹

联勤保障部队第909医院超声科，福建漳州363000

甲状腺结节是目前最常见的甲状腺疾病，其多见于女性，且患病率随着年龄的增长而逐步升高[1]。由于甲状腺结节具有良性和恶性之分。因此针对甲状腺结节的良恶性进行早期诊断，对于临床治疗策略的制定和实施非常关键。目前超声检查已广泛用于甲状腺结节疾病的检测和评估，然而普通二维超声在甲状腺结节良恶性的诊断上具有较大的局限性[2]。超声弹性成像是Ophir博士于1991年首先提出的。该技术基于不同组织的弹性系数不同，通过超声探测实体肿块的硬度，并同正常组织进行对比来鉴别其良恶性来达到诊断目的[3]。microRNA(miRNA)为一类广泛存在于真核细胞中的非编码单链小RNA分子。目前已有大量研究证实在肿瘤细胞中发现差异性表达的miRNA，且通过对这些肿瘤特异性miRNA的检测将极大地有助于对肿瘤性质的诊断[4-5]。miR-21是最近发现的一个与肿瘤相关的miRNA分子，有研究证实[6]miR-21的高表达与甲状腺恶性肿瘤的发生密切相关。该次研究通过超声弹性成像技术联合血清miR-21对2016年1月—2018年12月该院收治的180例甲状腺结节患者进行检测，探讨其在甲状腺结节良恶性鉴别诊断中的临床价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

随机选择该院收治的180例甲状腺结节患者作为研究对象。患者年龄27～53岁，平均年龄(32.7±6.5)岁；其中男性68例，女性112例。180例患者甲状腺结节直径0.4～5.2 cm，平均(0.86±0.42)cm。另选择30名健康体检者作为健康对照组。①所有受试对象术前均未进行针对甲状腺结节的治疗；②均排除合并脑、肺、肝、肾严重疾病；③均排除合并其他恶性肿瘤；④均排除严重急慢性感染性疾病。该研究术前均征得患者及家属的知情同意并签署知情同意书，并经医院伦理委员会批准。

1.2 超声弹性成像

①仪器：采用TOSHIBA公司的Acuson S2000彩色多普勒超声诊断仪进行检测。超声诊断仪器规格为线阵9L4探头，探头频率4～9 MHz，具备常规超声和弹性成像功能。②检查操作：患者平躺仰卧于检测床上，充分暴露检测颈部区域。先进行常规二维超声检查，对甲状腺横切面和纵切面进行连续超声扫描，观察和记录结节的部位、大小、形态、边界、内部回声、有无钙化、结节周边及内部彩色血流分布情况。根据常规二维超声确认目标病灶后进行实时组织弹性成像检测。设置超声弹性成像取样框，面积大小为病灶区域的2～3倍。取样框范围应包括病灶结节、结节周围甲状腺组织及其前方的胸锁乳头肌。将超声探头垂直置于体表病灶区，然后进行轻按压—解除按压操作，待图像稳定后采集弹性图像并存贮。③病灶弹性成像硬度评分：采用5分法评分标准：整体病灶区或着大部分病灶区显示呈均匀绿色(1分)；病灶中心区显示呈蓝色，周边区域显示呈绿色(2分)；病灶区显示呈现杂乱的蓝绿相间分布，绿色和蓝色所占比例相近(3分)；整体病灶区呈蓝色或病灶区内伴有少许绿色(4分)；整个病灶及周边组织区域均显示呈蓝色(5分)。评分1～3分者为良性，；4～5分者则诊断为恶性。所有患者均由一名具有10年以上超声临床诊断经验的医师进行超声弹性成像和弹性评分。

1.3 血清miR-21检测

①血清样本采集。所有受试者均凌晨空腹状态下抽取外周静脉血5 mL，室温下静置1 h，置于4℃，3 000 rpm/min条件下离心15 min，抽取上层血清置于新的EP管，集中统一编号后置于-80℃冰箱待下一步实验。②血清总RNA提取。采用Trizol试剂(购自Invitrogen公司)对提取血清总RNA。经过RNA分相、沉淀、洗涤、溶解后。RNA电泳检测提取RNA分子的完整性，NanodropRND-1000测定提取RNA的浓度。③逆转录(RT)。采用miScript Reverse Transcription Kit(天根生化科技有限公司)构建10μL反应体系：RNA 3μL，1×mirVana RT Primer 1μL，Array script Enzyme Mix 0.4μL，mirVana RT Buffer(5×)2μL，加RNase-free water至总体积10μL。反应条件：16℃，30 min；42℃，30 min；84℃，5 min。④实时荧光定量PCR反应：按照miRNA SYBR Green PCR Kit(天根生化科技有限公司)操作步骤构建20μL反应体系：1×cDNA模板1～2.5μL，5×Golden HS SYBR Green qPCR Mix 4μL，PCRForward Primer(20×)1 μL，PCR Reverse Primer(20×)1μL，50×ROX Reference Dye 0.4μL，加入Nuclease-free H2O至总体积20μL。反应条件：95℃变性15 s；60℃退火1 min，共45个PCR循环。采用2-ΔΔCT法分析miR-21表达的相对定量值。

1.4 统计方法

2 结果

2.1 病理结果

纳入研究的180例甲状腺结节患者术后病理检测证实良性结节96例，其中结节性甲状腺肿69例、甲状腺腺瘤20例、桥本甲状腺炎7例；甲状腺癌84例，其中甲状腺乳头状癌(PTC)72例，滤泡状甲状腺癌(FTC)8例，甲状腺髓样癌(MTC)4例。

2.2 超声弹性评分

良性结节组超声弹性评分明显低于甲状腺癌组，两组比较差异有统计学意义(t=3.847,P＜0.05)。超声弹性评分1～3分的结节患者有94例，其中12例为恶性，82例为良性；4～5分者有86例，其中72例为恶性，14例为良性。见表1。

表1 超声弹性评分与病理诊断结果比较[(±s)，分]

表1 超声弹性评分与病理诊断结果比较[(±s)，分]

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2.3 血清miR-21检测结果比较

良性甲状腺结节组患者血清miR-21相对表达水平为(0.73±0.21)，甲状腺癌组患者血清miR-21相对表达水平为(1.78±0.43)，甲状腺癌组患者血清miR-21表达水平明显高于良性甲状腺结节组患者(t=5.273,P＜0.05)。健康对照组人群血清miR-21相对表达水平为(0.49±0.13)，明显低于良性甲状腺结节组，差异有统计学意义(t=3.549,P＜0.05)，和甲状腺癌组比较，差异有统计学意义(t=9.476,P＜0.05)。见图1。

图1 各组血清miR-21表达

2.4 超声弹性成像和血清miR-21水平对甲状腺恶性结节的诊断效能

ROC曲线分析结果，超声弹性成像诊断甲状腺恶性结节的受试者工作特性曲线(ROC)下AUC为0.729，血清miR-21水平的ROC曲线下AUC为0.771，而联合超声弹性成像和血清miR-21诊断的ROC曲线下AUC为0.868，明显高于超声弹性成像(Z=3.477,P＜0.05)和血清miR-21(Z=3.762,P＜0.05)单个指标对甲状腺恶性结节的诊断价值，见图2。

3 讨论

普通二维超声是目前临床上首选的甲状腺病灶的检测技术。由于甲状腺结节性疾病存在的多源性，其病理类型比较复杂；因而良恶性甲状腺结节在二维超声检测声像图上的表现也呈多样性，且常有重叠交叉，因此普通二维超声在对甲状腺病灶良恶性的诊断效能上尚存在较大的局限性。有研究显示[7]，普通二维超声对甲状腺癌的诊断准确性仅在50%左右。

超声弹性成像技术检测肿瘤的基本原理是利用肿瘤组织与周围正常组织之间存在的弹性系数的差异，通过超声探头对检查肿块组织施加压力后，根据相应产生应变大小的不同，从而间接或直接反映被检查肿块组织内部的弹性大小，从而推断肿块组织的良恶性性[8]。目前临床上超声弹性成像检测技术已经应用于乳腺、甲状腺和淋巴结等表浅部位组织病变的诊断[9-10]。Lv等[11]采用内镜超声实时组织弹性成像检测42例消化系统实体瘤，结果显示其诊断消化系统恶性肿瘤的敏感性、特异性和准确性分别为91.4%、88.9%和87.5%，AUC值为0.80。提示内镜超声实时组织弹性成像能有效地鉴别消化道肿瘤的良恶性，提高诊断准确率，是鉴别诊断消化道肿瘤的有效方法。Kyriakidou等[12]采用超声组织弹性成像技术分析62例甲状腺结节患者(84个结节中良性73个，恶性11个)。其对甲状腺癌诊断的敏感性为73%，特异性为70%，阴性预测值为94%，诊断甲状腺恶性结节的AUC值为0.71；较普通二维超声更有助于对甲状腺结节的良恶性进行诊断筛查。该研究采用超声组织弹性成像技术对180例甲状腺结节患者进行检测分析，并以病理检测结果作为金标准。研究结果显示，甲状腺良性结节组超声弹性评分明显低于甲状腺癌组，即甲状腺癌组织的硬度要显著高于甲状腺良性结节。AUC值是反映ROC曲线诊断试验的敏感性和特异性连续变量的综合指标，AUC值越高，其诊断价值也越高。通过构建ROC曲线，超声组织弹性成像诊断甲状腺肿块良恶性的AUC值为0.795，提示超声弹性成像对甲状腺癌的诊断具有较高的准确性。然而，通过超声弹性成像技术在诊断甲状腺结节的良恶性上尚存在一定的误诊率。研究中超声弹性评分1～3分的结节中有12例为恶性，4～5分者则有14例为良性，因此存在一定假阳性和假阴性情况。分析其误诊的原因可能在于[13-14]：①甲状腺良性肿瘤发生纤维化和钙化引起甲状腺组织硬度增大；②甲状腺恶性肿瘤病灶很小；或者发生液化坏死导致其组织硬度减小；③操作过程中操作者施力度的大小、振动频率等主观因素的影响。以上因素都能对成像效果造成干扰，进而影响检测结果。

图2 超声弹性成像和血清miR-21诊断甲状腺结节良恶性的ROC曲线

MicroRNA(miRNA)是一类内源性非编码的短链小RNA分子。研究证实[15-16]，miRNA在人血液循环中稳定表达，且具有生物遗传和种属表达保守性的特点。因此，miRNA具有成为新的疾病监测标志物的潜能。miR-21是目前已知的具有癌基因特性的miRNA。赵等[17]研究发现，甲状腺癌患者肿瘤组织和血清中miR-21的表达明显升高，且其表达水平与甲状腺癌的临床病理特征有关，因而miR-21检测对甲状腺癌的诊断和判断预后上存在较高的临床价值。该研究中，数据分析结果显示miR-21在甲状腺癌组患者血清中的相对表达水平要明显高于良性甲状腺结节组患者和健康对照组。ROC曲线结果显示血清miR-21水平的ROC曲线下AUC为0.814。提示血清miR-21对于临床辅助诊断甲状腺癌具有积极的参考价值。然而，由于miR-21并非在甲状腺癌组织中特异性表达，恶性胶质瘤和乳腺癌等恶性肿瘤也会导致患者血清中miR-21的表达增高[18]。因此在特异性尚不够高，尚需要联合检测来弥补。进一步，该研究将超声弹性成像和血清miR-21联合起来对甲状腺结节的良恶性进行评估诊断。结果显示两者联合诊断甲状腺癌的ROC曲线下AUC为0.868，明显高于单个指标对甲状腺癌的诊断价值。提示超声弹性成像技术联合血清miR-21检测有助于对甲状腺癌的早期鉴别和诊断。

综上所述，弹性成像和血清miR-21联合检测能够从不同角度对甲状腺癌患者提供较为准确诊断，二者能够互补，减少误诊。但尚需开展大样本量的多中心的进一步研究和临床论证。进而为甲状腺结节良恶性的鉴别提供了更加简便、准确的诊断方法。