王璐璐，刘丹阳，李永涛，金海峰，姜杨，张善强，沈雷

1.齐齐哈尔医学院解剖学教研室，黑龙江齐齐哈尔161006；2.齐齐哈尔医学院组织胚胎学教研室，黑龙江齐齐哈尔161006

肺癌患病率位居恶性肿瘤之前列，全世界每年大约有60万人死于肺癌[1]。尽管手术、化学药物治疗或放射治疗等不同治疗策略被应用于临床实践，但是却仍然无法阻止肺癌的进展[2]。肺癌组织内也含有肺癌干细胞[3]，并认为肺癌干细胞有可能来源于间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSC）[4-5]，MSCs具有较强的归巢特性可能是造成肺癌等肿瘤浸润或发生转移的因素之一[5-6]。关于肺癌微环境对MSC增殖等细胞生物学影响还需要深入研究。

趋化因子能够与MSCs表面相应受体相互结合，促进细胞迁移归巢能力的肽类家族[7]。白细胞介素-8（Interleukin-8,IL-8）与乳腺癌、结肠癌转移和复发密切相关[8]。该实验从趋化因子角度验证肺癌A549细胞上清液对hBMSCs增殖和凋亡的影响，为抑制肺癌细胞增生提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 细胞

人正常肺上皮BEAS-2B细胞、人肺癌A549细胞和人骨髓间充质干细胞（Human bone marrow mesenchymal stem cells,hBMSC）均购于美国ATCC公司。

1.2 主要试剂和仪器

人IL-8、Akt、P-Akt蛋白ELISA试剂盒购于美国R&D公司；MTT、二甲基亚砜（DMSO）购于美国Sigma公司；Annexin V-PI细胞凋亡试剂盒购自美国Hyclone公司。美国Bio-Rad公司的Bio-Rad 550酶标仪；美国BD公司FACSAriaⅡ型流式细胞仪。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养10%胎牛血清的DMEM培养基分别培养BEAS-2B细胞和A549细胞；hBMSCs用含10%胎牛血清的α-MEM培养基培养。

1.3.2 提取细胞上清液4×106 BEAS-2B细胞和A549细胞在37℃，5%CO2培养12 h后，800 rpm离心5 min，分别提取两种细胞上清液，0.22μm滤器抽滤。

1.3.4 细胞分组BEAS-2B细胞和A549细胞上清液用含1%胎牛血清的α-MEM培养基按体积比1:4稀释为条件培养基（Conditioned medium，CM）。以A549 CM和BEAS-2B CM培养hBMSCs分别为A549-CM组和BEAS-2B CM组。正常培养的hBMSCs为对照组。

1.3.4 MTT细胞增殖实验0.8×104各组hBMSCs，分别加入各组条件培养基或正常培养基。37℃，5% CO2培养6 h后，加入5 g/L MTT溶液；37℃，5%CO2继续培养4 h，再添加DMSO。Bio-Rad 550酶标仪于490 nm检测细胞增殖吸光度（Absorbance value，A值）。

1.3.5 Annexin V-PI细胞凋亡实验3.5×105各组hBMSCs用1.25% Annexin V-FITC溶液重悬孵育20 min；10 000 rpm离心5 min；0.01 mmol/L PBS清洗3次，1 min/次；再加入2% PI溶液，4℃孵育2 min，10 000 rpm离心5 min；取上清液，0.01 mmol/L PBS重悬。FACSAriaⅡ型流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.3.6 ELISA 5×105各组hBMSCs，加入RIPA细胞裂解液及1 mmol/L PMSF，4℃，10 000 rpm离心5 min；BCA法测定蛋白总浓度。使用人Akt、P-Akt的ELISA试剂盒检测各种蛋白的含量。A549细胞上清液和BEAS-2B细胞上清液的IL-8蛋白含量使用人IL-8的ELISA试剂盒进行检测。

1.4 统计方法

采用SPSS 18.0统计学软件进行数据分析。计量资料用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验或方差分析；计数资料采用率（%）表示，组间比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 A549细胞上清液促进hBMSCs增殖

对照组、BEAS-2B CM组和A549-CM组hBMSCs的A值分别为（0.97±0.19）、（1.01±0.09）、（1.79±0.13），差异有统计学意义（F=125.93，P＜0.01）。

图1 A549细胞上清液对hBMSCs细胞凋亡的影响

2.2 A549细胞上清液抑制hBMSCs凋亡

对照组、BEAS-2B CM组、A549-CM组hBMSCs的凋亡率分别为10.81%、9.31%和6.05%，差异有统计学意义（χ2=15.75，P＜0.01）。A549-CM组hBMSCs的凋亡率分别是对照组的0.56倍和0.65倍，差异有统计学意义（P＜0.01）。见图1。

2.3 A549和BEAS-2B细胞上清液中IL-8蛋白的含量

ELISA实验发现，A549细胞上清液中IL-8含量是（18.16±2.23）μg/mL，BEAS-2B细胞上清液IL-8含量是（10.07±1.55）μg/mL，差异有统计学意义（t=14.510，P＜0.01）。

2.4 A549细胞上清液促进hBMSCs的Akt、p-Akt蛋白表达

对照组、BEAS-2B CM组、A549-CM组Akt、p-Akt蛋白含量比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。A549-CM组hBMSCs的Akt、p-Akt蛋白含量均比对照组和BEAS-2B CM组升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表1。

表1 A549细胞上清液对hBMSCs中Akt、p-Akt蛋白含量的影响比较[（±s），μg/mL]

表1 A549细胞上清液对hBMSCs中Akt、p-Akt蛋白含量的影响比较[（±s），μg/mL]

注：与对照组比较，#P＜0.01；与BEAS-2B-CM组比较，*P＜0.01

?

3 讨论

间充质干细胞与其微环境内的宿主细胞相互影响。王志红等[9]为探讨MSC归巢到电离辐射损伤的小鼠组织，将BALB/c小鼠经1.75 Gy X线进行全身照射4周，制备电离辐射诱发的胸腺组织损伤动物模型，并由小鼠尾静脉注入MSCs。结果发现照射组小鼠第1天MSCs即可出现在损伤胸腺组织内，第10天MSCs在放射胸腺组织内大量分布。MSC是肿瘤微环境的组成部分，但是恶性肿瘤组织招募MSCs的机制还不清楚。研究发现MSC诱导胃癌HGC27细胞迁移和侵袭，MSC尚可增加胃癌细胞Snail间质标志物表达，降低N-cadherin、E-cadherin上皮标志物表达，HGC27细胞与MSC联合培养能够增强胃癌细胞的干性，这为MSC在胃癌中的作用提供了新的证据，也为提高MSC靶向治疗胃癌的效率提供了机会[10]。

该实验模拟肿瘤微环境对MSCs增殖或凋亡的影响，对非小细胞肺癌A549细胞与骨髓间充质干细胞之间的关系展开研究。相对于对照组、BEAS-2B CM组的A值（0.97±0.19）、（1.01±0.09），A549-CM组hBMSCs细胞A值为（1.79±0.13），说明A549-CM组hBMSCs细胞增殖非常明显。但是3组细胞的凋亡率相比，A549-CM组hBMSCs细胞凋亡率约为5.64%，呈现显著降低趋势。Li W研究发现A549细胞在常氧条件下分泌HIF-1α蛋白，维持肿瘤生长和迁移，A549细胞Transwell迁移率约为89.26%，若以HIF-1 miRNA转染A549细胞抑制HIF-1α表达，则出现HIF-1α沉默显著抑制A549细胞迁移的情况，此时Transwell迁移率约为51.43%，提示A549恶性肿瘤细胞能够分泌促进肿瘤自身生长的HIF-1α细胞因子[11]。该实验发现A549细胞上清液中IL-8含量为（18.16±2.23）μg/mL，明显高于BEAS-2B-CM组上清液IL-8含量（10.07±1.55）μg/mL。国内学者李林等[12]在慢性阻塞性肺疾病（COPD）合并肺癌患者血清中也发现，41例COPD合并肺癌患者组血清内的IL-6、IL-8和TNF-α分别为（186.73±0.92）ng/L、（298.28±27.81）ng/L和（147.51±2.32）ng/L；41例单纯COPD组患者血清内IL-6、IL-8和TNF-α含量（20.92±22.67）、（45.47±15.94）、（86.04±1.05）ng/L，两组IL-6、IL-8和TNF-α指标分别比较发现COPD合并肺癌患者组血清内IL-6、IL-8和TNF-α含量比单纯COPD组明显高表达。由此可见，该实验的研究结果与李林等学者的研究结果相类似，即相对于单纯COPD细胞或正常肺上皮细胞，肺癌细胞能够高表达的IL-8细胞因子能够更好维持肿瘤细胞生长。可见IL-8等活性因子对促进肿瘤等细胞自身增殖，维持自我更新起到积极作用。

IL-8能够激活细胞内Akt-STAT3信号通路，启动微丝微管收缩而促进脂肪或骨髓源MSCs迁移[13-14]。IL-8与卵巢癌、前列腺癌等恶性肿瘤的分级分期密切相关，IL-8与肿瘤发生淋巴结转移（淋巴管新生）、血管转移（血管新生）呈现正向关系[15-16]，提示从趋化因子角度阐明非小细胞肺癌微环境对MSC的影响会有新发现。该实验ELISA试验证实A549细胞上清液中IL-8蛋白含量明显高于正常肺BEAS-2B细胞组，进一步说明A549细胞可以表达IL-8蛋白等趋化因子[12]。IL-8蛋白能够与MSCs表面的CXCR1/2受体特异结合，活化细胞迁移过程[13-14,17]。BEAS-2B-CM组hBMSCs的A值或细胞凋亡率与对照组无显著性差异的原因可能是由于正常人肺细胞BEAS-2B所表达的活性物质较少，在接下来的ELISA实验中也证实了BEAS-2B上清液中IL-8含量比非小细胞肺癌A549上清液IL-8含量低。实验发现，A549-CM组hBMSCs的Akt、p-Akt蛋白表达明显上调，这与学者研究发现的IL-8蛋白或IL-8受体活化后，能够促进晶状体上皮细胞等细胞迁移相类似[13,18]。Akt信号通路与很多已知调控细胞运动的Notch、Wnt等信号通路还诸多交叉作用[19-20]。关于A549细胞分泌的其他活性因子成分以及对MSCs的影响，还需要继续利用高效液相色谱技术、基因组学、动物实验等技术进行深入研究和验证。