虫草黄酮类化合物的生物活性及提取技术研究进展

2021-04-16齐楠王思强张彪佘新松

安徽农业科学 2021年5期

齐楠王思强张彪佘新松

摘要黄酮类化合物如染料木黄酮、大豆苷元等，是虫草的主要活性成分，具有多种生物活性，如免疫调节、抗肿瘤、抗病毒、抗炎症、抗氧化及清除自由基作用等。重点评述虫草黄酮类化合物的生物活性以及在提取黄酮类化合物方面的最新进展，分析该类资源在深度开发过程中出现的问题并予以展望，以期进一步扩大虫草黄酮类化合物在功能性食品和生物医药领域的应用市场。

关键词虫草;黄酮类化合物;生物活性;提取技术

中图分类号 R284.2文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2021）05-0014-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.05.004

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Research Progress on Biological Activity and Extraction Technology of Flavonoids from Cordyceps

QI Nan，WANG Si-qiang，ZHANG Biao et al

（College of Life and Environment Science，Huangshan University，Huangshan，Anhui 245041）

Abstract Flavonoids，such as genistein and daidzein，are the main active components of Cordyceps with a variety of biological activities，such as immune regulation，anti-tumor，anti-virus，anti-inflammation，anti-oxidation and free radical scavenging effects，etc.This paper focused on the biological activity of Cordyceps flavonoids and the latest progress in the extraction of flavonoids，analyzed the problems in the process of deep exploitation of this kind of resource and looked forward to the future in order to further expand the application market of Cordyceps flavonoids in the field of functional food and biomedicine.

Key words Cordyceps;Flavonoids;Biological activity;Extraction technology

黃酮类化合物（flavonoids）又称为类黄酮，不是指某一种化合物，而是一组化学结构相同或相似、具有相同活性的某一类物质。黄酮类化合物是自然界中分布最广泛的天然活性成分之一，存在于蔬菜、水果、花卉、树皮、根、茎和叶子中，特别在某些药用植物当中含量极其丰富[1-2]。黄酮类化合物作为一种活性成分，具有抗氧化、抗菌、抗炎等作用[3-4]，还可以调节血糖、血脂和血压[5-6]。目前，尽管化学合成方法发展迅速，但大多数黄酮类化合物仍然来源于天然植物原料中[7]，易受季节的影响，且相对而言，从植物中提取的黄酮类有效成分含量较低，造成市场上黄酮类相关产品的价格上涨。因此，从虫草属真菌中提取黄酮类物质已成为一种极具前景的生产方式。

虫草是一类珍贵的昆虫病原真菌，在真菌和昆虫漫长的协同演变过程中，产生了大量的功能性成分，如核苷、固醇、多糖、虫草酸、氨基酸、多肽等。现代药理学研究证实，虫草具有多种生物活性，如抗肿瘤、抗菌、抗辐射、抗炎，抗衰老、免疫调节、抗氧化、抗细胞凋亡、治疗糖尿病、止痛和抗过敏等[8-17]。

近年来，国内外对虫草的研究侧重于虫草素、蛋白质、虫草多糖、多肽、微量元素、甘露醇、虫草酸、腺苷、色素、核苷等常见成分的提取和相关药理作用的研究，而对于虫草黄酮类化合物的相关研究相对较少，欠缺系统性的整理及归纳。为更好地研究和开发、利用虫草资源，笔者拟对虫草黄酮类化合物的生物活性及其提取进行系统整理与概括，对该类资源研发过程中存在的问题进行分析并予以展望，为进一步开发和利用虫草黄酮类化合物提供新思路。

1 虫草中黄酮类化合物

黄酮类化合物最初指的是一类基于2-苯基色原酮的化合物，目前，它指的是一系列通过中央三碳结构与含有酚羟基的苯环相连的化合物[18]。黄酮类化合物主要包括染料木黄酮、大豆苷元等，已从虫草中分离出的黄酮类化合物有4种新型异黄酮甲基糖苷：大豆苷元7-O-β-D-葡萄糖苷4″-O-甲酸酯、黄豆黄素7-O-β-D-葡萄糖苷4″-O-甲酸酯（glycitein-7-O-β-d-glucoside-4″-O-methylate，CGLM）、染料木黄酮7-O-β-D-葡萄糖苷4″-O-甲酸酯和染料木黄酮4′-O-β-D-葡萄糖苷4″-O-甲酸酯[19]，以及4′-羟基异黄酮-7-O-β-4″甲氧基葡萄糖苷（4″-甲氧基大豆苷）、5，4′-大豆黄素-7-O-β-4″甲氧基葡萄糖苷[20]和6，7，2′，4′，5′-五甲氧基黄酮[21]。

2 虫草黄酮的生物活性

相关研究表明，虫草黄酮具有多种生物活性。近年来，对虫草黄酮的活性研究多集中在免疫调节、抗肿瘤、抗病毒、抗炎症、抗氧化、抑菌作用和镇静、催眠作用（图1）。

2.1 免疫调节

虫草黄酮可以通过控制慢反应致炎物质的释放而发挥免疫活性。Oh等[22]研究表明蛹虫草乙酸乙酯提取物对抗原引起的RBL-2H3细胞脱颗粒和被动皮肤过敏应答具有强烈的抑制作用，其反应机理是抑制Syk、ERK、p38和JNK等蛋白的磷酸化表达。Park等[23]随后证实，蛹虫草乙酸乙酯提取物中所含的染料木黄酮及其甲基糖苷类衍生物抑制脱颗粒的作用最强，可减少受抗原刺激的RBL-2H3细胞释放IL-4和TNF-α，下调Lyn、Syk、PLCγ1和LAT蛋白的活化水平，并抑制AKT和ERK1/2蛋白的激活。因此，虫草黄酮可作为过敏性疾病治疗剂的来源之一。

2.2 抗肿瘤、抗病毒

虫草黄酮对肿瘤细胞会产生细胞毒效应，这是黄酮类化合物发挥抗肿瘤效应的主要途径之一。在蛹拟青霉菌株的发酵液中发现的3种新的化合物（4″-甲氧基大豆苷、6-甲氧基-4′-羟基异黄酮-7-O-β-4″甲氧基葡萄糖苷、4″-甲氧基染料木苷）均显示出对CHO细胞的强烈毒效应，但它们被认为可能是培养基的转化产物[24]。随后，廖敏等[20]又自蛹拟青霉中分离出4″-甲氧基大豆苷，这表明虫草黄酮具有抗肿瘤作用。

此外，黄酮类化合物对病毒也有显著的抑制效果，如已报道的抗流感病毒、抗乙型肝炎病毒和抗柯萨奇病毒等[25]。Jiang等[21]通过树脂吸附层析法和HPLC对蛹虫草黄酮进行分离、纯化，得到6，7，2′，4′，5′-五甲氧基黄酮，该化合物显示对HIV-1蛋白酶的高度抑制作用，可能是新的HIV-1病毒药物。

2.3 抗炎症

虫草黄酮可通过调节NF-κB因子来抑制炎症因子的表达，从而产生抗炎效果。Kim等[26]从生长在发芽大豆提取物中的虫草中分离出一种新的异黄酮化合物（CGLM），CGLM能够直接抑制NCI-H292细胞中NF-κB的活性，并显著抑制p38 和ERK1/2的磷酸化，保护人肺黏液上皮样细胞NCI-H292免受表皮生长因子引起的损伤。

2.4 抗氧化

Yu等[27]探究蛹虫草提取物中具有明显抗氧化作用的功能成分，结果发现，蛹虫草中具有较高含量的虫草素和腺苷并没有表现出显著的抗氧化活性，其抗氧化能力可能与蛹虫草中黄酮类等物质清除自由基的能力有关。关于虫草黄酮是否具备较强的抗氧化活性，已成为时下研究热点。

杨申明等[28]采用体外模型从3个角度评价虫草花中总黄酮的抗氧化能力，即测定其对·OH、O 2·-和DPPH·的清除能力，研究结果显示在一定的试验浓度范围内，总黄酮与3种自由基的清除率呈现良好的线性关系，表明虫草花黄酮具有一定的抗氧化功能。赵聃聃[29]研究发现兰坪虫草菌丝体中的黄酮类化合物清除自由基的能力更强，随黄酮提取液浓度的上升而逐渐提高。张曦文等[30]测定白化型蛹虫草中虫草酸、可溶性蛋白和黄酮等主要活性成分含量，并与其水提物的抗氧化活性进行比较，得出黄酮的含量相对较高，在抗氧化活性物质中占主导地位，表现出较强的活性。刘晓红等[31]测定蛹虫草样品对DPPH·、O 2·-清除能力和铜离子还原能力，比较新鲜的蛹虫草和干制的蛹虫草之间抗氧化活性的差异，结果表明新鲜的蛹虫草具有更明显的抗氧化活性。

2.5 抑菌作用

黄酮类化合物是一类pH偏弱酸性的酚类物质，会破坏微生物的蛋白质，使微生物发生功能紊乱，抑制微生物的生长或导致它们的死亡。罗珊珊[32]设计抑菌活性试验，研究九州虫草黄酮提取物对大肠杆菌、黑曲霉和白色念珠菌等的抑菌效果，初步证实了九州虫草黄酮具有一定的抑菌作用，其中细菌的抑菌作用最强，对一些病原真菌也有比较明显的抑菌作用，结果显示最佳抑菌浓度为0.5 mg/mL，最低抑菌浓度随菌种的不同而发生变化。

2.6 镇静、催眠作用

黃酮类化合物也是虫草发挥镇静催眠作用的重要物质基础。安丽萍等[33]以小鼠自主活动的次数、大脑中的乙酰胆碱（Ach）、谷氨酸（Glu）、5-羟色胺（5-HT）和 γ-氨基丁酸的含量为指标研究蛹虫草总黄酮的镇静、催眠作用及其机制，结果揭示蛹虫草总黄酮可发挥镇静、催眠功效，其作用机制可能是通过上调人脑中5-HT的含量，并下调Ach和Glu的含量，从而起到镇静、催眠的作用，而对γ-氨基丁酸的含量没有明显的影响。

3 虫草黄酮的提取技术

从提取物的性质、对工业化的适用程度和环保等角度考虑，虫草黄酮的提取方法主要分为传统的提取法和现代的提取法。传统的提取方法即指溶剂提取法，现代的提取方法有超声波辅助提取、微波辅助提取、超临界流体萃取技术（图1）。

3.1 溶剂提取法

溶剂提取法是一种常规的提取方法，目前在实验室中应用广泛。黄酮类化合物一般都带有酚羟基，因此易溶解于极性强的溶剂，如水、甲醇、乙醇等，其中乙醇毒副作用小最为常用。近年来，国内研究人员采用溶剂提取虫草黄酮的研究应用较多。罗珊珊等[34]采用正交试验设计，使用乙醇回流法从九州虫草和冬虫夏草中提取黄酮类化合物，发现料液比在1∶40（g∶mL）时，用80%乙醇提取3 次，每次提取3 h，提取温度为80 ℃，虫草黄酮提取率最高，可达3.730 mg/g。杨申明等[28]分别使用甲醇、乙醇、乙酸乙酯和水对虫草花进行总黄酮的提取，发现用甲醇和乙醇提取虫草花总黄酮时，其含量大大高于用乙酸乙酯和水进行总黄酮提取时的总黄酮含量，但当甲醇和乙醇用作提取溶剂时，两者总黄酮的含量并无差别。孙晶波等[35]使用正交试验优化提取不同来源的北冬虫夏草总黄酮，结果显示，以40 倍量的70%乙醇，90 ℃单次回流4 h时，提取虫草总黄酮的效果最佳。

综合以上结果可以看出，溶剂提取法对于提取温度要求较低，工艺设备简单，操作安全，所需成本低，但此法提取会产生大量杂质，低回收率，提取物的过滤、浓缩和其他操作需要很长时间以及大量有机溶剂的使用，可能会造成溶剂污染，因此该方法更适合小规模提取。

安徽农业科学2021年

3.2 微波辅助提取

微波辅助提取的原理是不同材料吸收微波能量的能力不同，可以有选择地加热材料，在材料细胞内产生瞬时的高温高压，造成材料细胞壁的破裂，降低传质阻力，从而达到快速溶解、提取材料中活性成分的效果[36]。此法适用于热不稳定性物质的提取，具有能耗低、无污染的优势，特别是该方法能够选择性提取不同的药材，非常适合用于天然产物的提取，具有推广使用价值。罗珊珊等[37]通过正交试验研究乙醇回流法、微波法和超声波破碎法从蒙山九州虫草不同部位提取黄酮的最适工艺，得出从虫草子座中提取的黄酮含量最高，微波法提取效果最好，超声波破碎法次之，而乙醇回流法最低。然后，使用单因素试验和正交试验优化微波提取九州虫草黄酮工艺，即在料液比为1∶25（g∶mL）、140 W的微波功率下，提取1.5 min，所得总黄酮产量高达9.35 mg/g[38]。刘春泉等[39]研究微波法从北冬虫夏草中提取黄酮的最佳工艺，在北冬虫夏草子座干粉粒径为60 目，用水进行提取，确定料液比为1∶25（g∶mL），微波功率120 W，提取3 次，提取10 min，此时黄酮提取率最高，达14.69 mg/g。

与传统提取方法相比，采用微波辅助提取虫草类黄酮，能大幅度缩短提取时间，节约能源，提高提取效率，然而用该方法来提取一些非极性物质并未取得良好的成效。

3.3 超声波辅助提取

超声波辅助提取的作用机制是利用超声波的空化作用、机械作用和热效应增强介质的渗透能力，打破细胞壁，达到加速中草药活性成分溶出的目的[40]。张国英等[41]首次使用超声波辅助提取技术从九州虫草子座中提取黄酮类化合物，基于单因素试验得出最佳工艺参数（料液比为1∶25，70%乙醇和提取时间30 min），从九州虫草子座中所得的黄酮含量为2.432 mg/g。张永明等[42]考察了溶剂提取法和微波、超声波辅助提取法从古尼虫草中提取总黄酮，通过正交试验设计优化试验条件，确定古尼虫草中总黄酮提取的最适工艺参数，结果发现超声波提取效果最佳，在料液比为1∶30（g∶mL）的情况下，用85%乙醇、80 ℃ 超声提取10 min，古尼虫草中总黄酮的提取率高达6.56 %，与银杏根中总黄酮含量相当，此法效率高、速度快。

应用超声波技术辅助提取虫草黄酮类物质，极大地促进了有效成分的扩散和溶出，大大减少直接用溶剂提取的时间，提取率高，具有节能、省时、操作简便等优点。但在传播过程中超声波的强度会随着作用区域的扩大而逐渐减弱，因而超声辅助提取对提取容器的直径大小有限制，对于所需的超声设备要求较高，因此在目前的工业化生产应用当中还存在一定的局限性，有待进一步研究应用。

3.4 超临界流体萃取

超临界流体萃取（SFE）是现代颇为流行的一种“绿色化工提取技术”，在研究天然药用植物活性成分当中被广泛使用。临界点流体具有强渗透性和高溶解能力，目前，CO 2是最常用的超临界流体。该技术与虫草黄酮传统的提取方法大为不同，其特征是高萃取效率和无溶剂残余物，可以有效防止热敏性成分的逸散和活性物质被氧化破坏，操作简便安全，可以通过准确控制临界点温度和压力来实现有选择地提取、分离和纯化出虫草黄酮，但这种方法可供选择的溶剂种类有一定的限制，且所耗费的成本高，设备的先进与否严重影响了有效成分的品质和得率。朱建民等[43]在温度40 ℃、压强25 MPa条件下，静态萃取30 min，再动态萃取120 min，CO 2的流速为1.0 L/min，使用超临界CO 2流体萃取技术提取九州虫草总黄酮，获得的黄酮含量为1.89 mg/g。

较之于溶剂提取法、超声和微波提取法，超临界提取的黄酮纯度高、杂质少，后续处理步骤少，测定的准确性高。此外，处于高临界区域的流体化学性质稳定，本身对人体无毒性，不易产生污染，安全性高，因此，超临界流体萃取技术非常适用于工业化生产中大规模提取虫草黄酮，根据虫草黄酮的性质，正确选择萃取时的压强、温度、萃取粒子的直径、流体流速和萃取溶剂等参数是提高提取效率的关鍵。

4 结语与展望

虫草的物种多样、资源丰富，是一类珍贵的药用真菌资源。近年来，国内外许多研究人员已对虫草黄酮的生物活性及其提取进行了一定深度的研究，也取得了不少成果，但是，纵观当前虫草黄酮的相关研究进展，总体上还处于起步阶段，离产业化开发应用还有很大的距离。目前，尚存在以下几个问题：

（1）虫草黄酮类成分和虫草活性研究不同步。目前，大量研究证实虫草具有多种生物活性，但这些研究大多表明虫草生药或其提取物具有某种生物活性，并没有证实是虫草中黄酮类成分发挥相应功效或明确与其活性相关的黄酮类单体物质。

（2）有关虫草黄酮生物活性的研究仍然存在不足，单一虫草黄酮成分与其生物活性的构效关系及作用机制目前尚不清楚，还不足以为虫草黄酮类化合物的开发应用提供理论依据。

（3）天然活性成分提取常用的一些现代技术，如协同辅助提取、半仿生提取法、高静压萃取（HHPE），尚未用于虫草黄酮的研究应用，难以实现虫草黄酮的高效提取。

（4）不论采用传统提取法还是现代提取法提取虫草黄酮，大多数研究都是基于单因素试验，并采用正交试验设计进一步优化提取工艺，试验次数较少，只能处理离散水平值，分析并不全面。

因此，针对以上问题，当前对虫草资源的应用应该在现有的生物活性研究基础上，着力加强对与其活性相关的物质研究，即黄酮类化合物的系统研究，创新、优化虫草黄酮提取工艺，明确各黄酮类单体化合物的化学结构、提取和纯化方法，探究虫草黄酮与其生物活性的构效关系、作用机制，这将有助于进一步开发虫草黄酮在功能性食品和生物医药领域的应用市场，创造更大的社会效益和经济效益。

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