彭 颖 周文蔚 姚 慧 刘志薇 张 琛 魏国清

(安徽农业大学生命科学学院，安徽合肥 230036)

桑黃是一种珍贵的药用真菌，在分类学上属于真菌界 (Fungi)担子菌门 (Basidiomycota)蘑菇纲 (Agaricomycetes)锈革孔菌目 (Hymenochaetales)锈革孔菌科 (Hymenochaetaceae)木层孔菌属 (Phellinus)[1]，多生于杨、柳、桦树等阔叶树的枯立树枝或者树干上，其子实体的大小不一，外观形态均接近褐色马蹄形，难以通过形态特征进行鉴别。因此，桑黄曾经的学名有鲍姆木层孔菌 (Phellinusbaumii)、裂蹄木层孔菌 (Phellinuslinteus)、火木层孔菌 (Phellinusigniarius)等[1]。直至2012年，吴声华[2]研究表明桑黄是未曾发表过的新种Inonotussanghuang，而后桑黄被归于新属桑黄孔菌属 (Sanghuangporus)[3]，学名改为桑黄 (Sanghuangporussanghuang)。由于过去一段时间的桑黄物种分类不明确，常有同名异物、同物异名的现象发生[4-5]，这非常不利于对桑黄的进一步研究与开发利用 。

桑黄是一种多年生的药用真菌，具有增强机体免疫力、抗肿瘤、抗脂质过氧化、抗肺炎、降血糖等作用[6]，引起了国内外医药与保健品行业研究与开发的兴趣，市场前景广阔，但是桑黄对于生长环境要求较高且桑黄的开发力度大，使得野生的桑黄资源非常稀缺。目前，人们已经实现了桑黄的工厂化人工袋料栽培[7-9]。

虽然无法直接由形态特征区分桑黄的不同品种，但为了适应不同地理、生态条件，桑黄菌株的基因组产生了一定的变异，从而可为桑黄的分类鉴定提供分子基础。核糖体DNA (ribosomal DNA，rDNA)具有广泛的异种同源性，其编码区序列较为保守，而非编码区序列进化速率快，具有丰富的变异，在不同形态的真菌物种间表现出较高的差异性[10-11]。尤其是rDNA基因内转录间隔区(internal transcribed spacers，ITS)又分为18S rDNA与5.8S rDNA之间的转录间隔区1(rDNA ITS1)和5.8S rDNA与28S rDNA之间的转录间隔区2(rDNA ITS2)。rDNA ITS1和rDNA ITS2都是中度保守序列，均表现为种内相对一致、种间差异比较明显的保守性[12]，即使是亲缘关系非常近的2个种也能够在rDNA ITS序列上显示出差异，从而表现出序列的多态性[13]。rDNA ITS序列分析技术具有稳定性好、准确度高、特异性强等特点[14]，因此成为真菌分子鉴定及系统发育分析的常用方法。

本文通过对桑黄Y1菌株rDNA ITS的克隆与分子进化分析，期望能够为桑黄的分类及鉴定奠定基础，也为其他真菌的分类和鉴定提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株 桑黄菌株Y1为安徽农业大学蚕丝生物技术实验室保存。

1.1.2 主要试剂 DNA提取试剂盒，购自北京Transgene公司；DNA纯化回收试剂盒，购自美国Axygen公司；限制性内切酶、DNA Marker，购自日本TaKaRa公司；其他试剂，购自生工生物工程(上海)股份有限公司，均为分析纯。

1.1.3 主要仪器设备 S1000PCR仪，购自美国BIO-RAD公司；Tanon-2500凝胶成像系统，购自上海天能科技有限公司；SYC-2101水平摇床，购自美国精骐有限公司；电泳槽、DYY-6C/PowerPAC3000电泳仪，购自北京六一生物科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 培养基的配制 母种培养基按照周蔓[4]的方法配制马铃薯、葡萄糖、琼脂[potato dextrose agar (medium)，PDA] 固体培养基。

1.2.2 桑黄菌丝的培养 将低温保存的桑黄Y1菌株接种到试管斜面固体PDA培养基后，26 ℃恒温活化5～7 d，再转管2次，恒温培养5～7 d后，即可获得活力旺盛的菌丝。

1.2.3 桑黄全基因组DNA的提取 取适量桑黄菌丝置于事先灭菌的研钵中，用液氮研磨成粉后转移至离心管中。然后利用DNA提取试剂盒从桑黄Y1菌株的菌丝中提取其全基因组DNA，检测所提取的DNA的质量，将获得的桑黄Y1菌株的基因组DNA置于-20 ℃冰箱中保存备用。

1.2.4 桑黄Y1菌株rDNA ITS序列的PCR扩增及产物胶回收 以提取获得的桑黄Y1菌株基因组DNA为模板，上游引物为5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′、下游引物为5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，对桑黄rDNA的ITS序列进行PCR扩增。反应体系为20 μL，反应条件为94 ℃预变性4 min→94 ℃变性30 s→55 ℃退火30 s→72 ℃延伸1 min，循环35次→72 ℃总延伸10 min。PCR反应完成后，用1%琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增产物，并利用DNA纯化回收试剂盒将目的条带纯化回收。

1.2.5 连接反应 将回收产物与pMD19-T载体连接，反应体系为10 μL，4 ℃连接过夜。

1.2.6 转化大肠杆菌TOP10感受态细胞 将连接产物与50 μL大肠杆菌感受态细胞轻轻吹打，混匀；再在冰上静置30 min；42 ℃水浴热激1 min；之后迅速转移至冰浴中，静置2 min；取600 μL不含抗生素的LB无菌液体培养基加入到2 mL离心管中，置于37 ℃、170 r/min的摇床中复苏1.5 h；在无菌操作台上取100 μL菌液均匀涂布到含氨苄青霉素 (Amp+)的LB固体培养基上；最后将平板倒置于37 ℃恒温培养箱中倒置培养过夜。

1.2.7 菌液PCR鉴定 取若干已灭菌的PCR管加入20 μL含Amp+的LB液体培养基，挑取单菌落，做好标记，置于相应的PCR管中混匀。另取对应数量的PCR管进行菌液PCR，反应体系为20 μL，反应条件为94 ℃预变性4 min→94 ℃变性30 s→55 ℃退火30 s→72 ℃延伸1 min，循环35次→72 ℃总延伸10 min。完成后，利用1%琼脂糖凝胶电泳分析菌液PCR扩增产物，得到阳性克隆后，将相应菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.2.8 rDNA ITS序列比对及系统发育分析 在GenBank中选择并下载12个木层孔菌属桑黄同源物种及1个外群物种——杜波特集毛孔菌(Hydnochaeteduportii)的rDNA ITS序列(表1)，利用ClustalX对测得序列与下载序列进行完全比对，再利用Mega7.0软件分析桑黄rDNA ITS1、5.8S rDNA、rDNA ITS2及rDNA ITS序列的长度、鸟嘌呤胞嘧啶含量(G+C)、碱基转换数、颠换数、总替换数及转换与颠换的比值，并计算各菌株间的遗传距离，采用邻接法(neighbor-joining，NJ)构建系统进化树。

表1 13个菌株材料的rDNA ITS序列登录号

2 结果与分析

2.1 桑黄Y1 rDNA ITS序列的PCR扩增

利用通用引物对桑黄Y1菌株的rDNA的ITS片段进行PCR扩增，PCR产物电泳结果表明：扩增产物能产生均匀的单一条带(图1)，且无拖尾与降解现象，长度大约在750 bp左右，与预测片段大小基本一致，说明该扩增产物可供进一步纯化与克隆使用。

图1 桑黄Y1 rDNA ITS序列PCR扩增产物的1%琼脂糖凝胶电泳结果

2.2 桑黄Y1 rDNA ITS的序列分析

经测序表明，桑黄Y1的rDNA ITS序列总长度为709 bp，由长度为311 bp的rDNA ITS1序列、长度为154 bp的5.8S rDNA 序列、长度为244 bp的rDNA ITS2序列构成。从表2可以看出，Phellinus属真菌的rDNA ITS序列长度区别明显，P.baumii、P.linteus、P.igniarius的rDNA ITS区域序列总长度分别为669～747 bp、608～706 bp、603～612 bp；而rDNA ITS1序列长度分别为284～328 bp、285～300 bp、217～225 bp；5.8S rDNA 序列长度完全一致，均为154 bp；rDNA ITS2序列长度分别为231～265 bp、169～252 bp、232～233 bp。相较而言，P.baumii的rDNA ITS区域序列、rDNA ITS1序列及rDNA ITS2序列都较长，而P.igniarius的rDNA ITS区域序列、rDNA ITS1序列及rDNA ITS2序列则较短。进一步比较分析Phellinus属真菌的rDNA ITS序列的碱基构成，发现rDNA ITS1及rDNA ITS2序列的G+C含量存在一定的差异，除了P.baumii-1及P.igniarius-2外，其它菌株rDNA ITS1序列的G+C含量均少于rDNA ITS2序列的G+C含量，而5.8S rDNA 序列的G+C含量完全一致。总序列的G+C含量基本接近50%，说明无碱基偏好。比较发现桑黄Y1的rDNA ITS序列构成与P.baumii的序列构成较为相似，可初步判断桑黄Y1为P.baumii。

表2 桑黄Y1 rDNA ITS序列长度及G+C含量变异分析

分析桑黄属rDNA ITS序列的碱基替换数得到表3，从表3可以看出，各菌株rDNA ITS1序列的碱基替换数与rDNA ITS2的碱基替换数相比明显增多，而5.8S rDNA的碱基替换数与rDNA ITS1、rDNA ITS2相比则明显减少，各菌株都只有4个碱基发生替换，说明5.8S rDNA序列较为保守。此外，碱基替换在rDNA ITS1与rDNA ITS2序列中发生较多，而rDNA ITS1序列比rDNA ITS2序列更易发生碱基替换。在rDNA ITS总序列的碱基转换数与碱基颠换数比例基本接近1∶1，其中rDNA ITS1序列的碱基转换数明显少于碱基颠换数，而rDNA ITS2序列则相反；另外，5.8S rDNA序列的碱基转换数也多于碱基颠换数。可见，碱基颠换在rDNA ITS1序列出现的可能性更高，而碱基转换则更有可能发生在rDNA ITS2序列中，但总序列发生碱基转换与颠换的频率基本相同。

表3 桑黄属ITS序列碱基替换数

图2 桑黄各菌株rDNA ITS1序列比对结果

图3 桑黄各菌株5.8S rDNA序列比对结果

从桑黄各菌株的rDNA ITS序列比对结果 (图2-4)可以看出，桑黄各菌株的5.8S rDNA序列同源性达100%，序列完全一致，说明5.8S rDNA序列在进化上极端保守；而rDNA ITS1序列和rDNA ITS2序列既有同源性达100%的区域，也有同源性大于75%的区域，同时还存在同源性大于50%的区域，说明rDNA ITS1和rDNA ITS2序列虽然也具有一定的保守性，但是仍然保留了很多变异位点，呈现出显著的序列多态性，这也为利用rDNA ITS序列鉴别桑黄的种属及进行系统进化分析提供了一定的依据。同时还可以发现P.linteus与P.baumii的rDNA ITS序列同源性相对更高，而P.igniarius的rDNA ITS序列与这两者的rDNA ITS序列同源性相对较低，存在很多缺失位点，说明P.igniarius的rDNA ITS序列与这两者的rDNA ITS序列存在一定程度的分化。

图4 桑黄各菌株rDNA ITS2序列比对结果

2.3 基于桑黄rDNA ITS序列的系统发育分析

本研究以桑黄Y1菌株的rDNA ITS序列及从GenBank中获取的其它13个真菌的rDNA ITS序列为依据，利用Mega7.0软件计算出各菌株间的遗传距离，结果列于表4。从表4可以看出，桑黄Y1与P.baumii的遗传距离最近，说明它们的亲缘关系较近；桑黄Y1与P.igniarius的遗传距离较远，说明它们的亲缘关系较远，从而可以进一步推断桑黄Y1在分类学上应属于P.baumii。从表4还可以发现，P.baumii和P.linteus之间的亲缘关系相对较近，意味着它们种群之间基因交流频繁，产生分化的时间可能较晚，但是这两者都与P.igniarius有着较远的亲缘关系，存在明显的遗传分化。P.baumii-3与P.baumii-4以及P.baumii-3和P.baumii-4这两者与P.baumii-1和P.baumii-2也存在一定的种间分化；P.linteus-1与其他3个P.linteus之间也存在明显的遗传分化。

表4 各菌种序列间的遗传距离

以H.duportii为外种群，依据Y1的rDNA ITS序列及从GenBank中获取的其它12个真菌的rDNA ITS序列信息，采用NJ法构建系统发育树 (图5)，从图5可以看出，Phellinus属真菌存在明显聚类，可分为3个类群，类群I为P.baumii，类群II为P.linteus，类群III为P.igniarius。在系统进化树中类群I、类群II、类群III又分为两大支，类群I与类群II聚类在一起，说明它们两者的同源性更高，亲缘关系更近，而类群III则产生了一定的分化。Y1与P.baumii聚类在一起的相似性为99%，因此可以进一步推断Y1为P.baumii。此外，与各菌株rDNA ITS序列信息分析的结果相比，具有较高的一致性，进一步体现了基于桑黄rDNA ITS序列的系统发育树的可信度。

图5 基于桑黄rDNA ITS序列的系统发育树

3 小结与讨论

长期以来，真菌主要通过形态学特征鉴定和生理生化指标鉴定来鉴定其种属，如通过观察菌落及子实体形态特征、分析菌丝的酯酶同工酶、鉴定子实体成分等方式来鉴定真菌种属[15-16]。但是很多真菌的菌落及其子实体形态极为相似，而且形态学观察不仅易受环境等客观因素的影响，还易受观察者自身的主观因素影响，因此，仅通过形态学观察对难以分辨真菌的鉴定易产生较大的误差，所耗时间还长，存在一定的局限性[4，17]。而生理生化指标也易受多种因素的影响，存在较大的不稳定性[18]。近年来随着分子生物学的发展，真菌分类鉴定的途径也有了更多的选择，不再局限于形态学及生理生化鉴定。目前，分子鉴定技术相较于传统的真菌分类鉴定技术，具有操作简单、特异性好、可靠性高，且不受外界环境干扰，能够直接反映出菌株的遗传本质等特点[14，18]。主要的分子鉴定技术包括随机扩增多态性分析技术(RAPD)、DNA限制性片段长度多态性分析技术(RFLP)、SSR分子标记技术、rDNA ITS序列分析技术等，这些分子鉴定技术目前已广泛应用于真菌的分类鉴定、遗传多样性和亲缘关系分析等[18]。但是相较于RAPD在鉴定中的低可靠性和低重复性，RFLP的高技术要求及在鉴定某些物种时存在的较低灵敏性，rDNA ITS所具有的优点如进化速率快、序列多态性广泛等对真菌的分子鉴定有着更好的灵敏性和准确性，从而适用于不同物种的分类鉴定和系统发育研究。迄今为止，已成功应用于Lactarius属真菌、Armillaria属真菌、Puccinia属真菌、Pneumocystis属真菌、Alnus属真菌等多种真菌的分子鉴定中[10，19-20]。利用rDNA ITS序列分析技术，可获得足够的信息，从而准确检测出真菌属间、种间以及菌株间的碱基对差异；反映出菌株的亲缘关系与分类情况。已经广泛应用于同一菌种不同菌株、真菌近似属间及同属近缘种间的系统发育研究，能够快速鉴别出利用传统形态学方法无法区别的相似菌株[4，10，16]。

基于rDNA ITS序列的分子鉴定技术对桑黄种内菌株的遗传多样性及亲缘关系进行分析，不仅研究了桑黄的进化历程，也为我国桑黄资源开发利用、资源保护、品种选育、栽培技术等研究提供理论依据[21]。但是目前，桑黄菌种用名混乱，GenBank中收录的菌株信息不够标准，而标准菌株的数量又较少，缺乏完整性。因此，有时仅靠分子鉴定也无法区别那些富有争议、来源不清的菌株，还需要结合形态学鉴定及生理生化分析，才能真正鉴别桑黄菌株及进行可靠的系统发育分析。随着分子生物学的进步，人们将会开发出更具代表性的分子标记技术，届时，对桑黄的分类、遗传多样性、系统进化等方面的研究都将起到巨大的推动作用。