丁雪粉,张德芳，吕海淼,彭 展,闫琛博,杨德新,王新庄* (.河南农业大学 牧医工程学院，河南 郑州 450000；.河南省科技信息研究院，河南 郑州 450000)

在体外特定的培养条件下，兔原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)可以重编程为生殖干细胞(embryonic germ cells,EGCs)，EGCs具有和胚胎干细胞(embryonic stem,ES)相似的生物学特性，为再生医学的研究提供合适的种子细胞[1]。在体外，培养液中加入特定的诱导因子，PGCs可以定向分化为成熟的生殖细胞，这方面的研究在生殖生物学上有着举足轻重的地位[2]。PGCs在体外培养过程中很容易发生凋亡和分化，因此需要对PGCs的体外培养条件进行探索和优化，以促进PGCs转分化为EGCs，并阻止其分化和凋亡。有很多学者探索PGCs的体外培养条件，这对大规模培养PGCs非常有意义。本研究以胎兔为研究对象，比较了胎龄、血清(fetal bovine serum,FBS)、血清替代物(knockout serum replacement,KSR)、维甲酸(retinoic acid，RA)、福司柯林(forskolin，FK)和三苯氧胺(4-hydroxytamoxifen，4OHT)等因素对PGCs分离培养的影响，并探究其生物学特性，完善兔PGCs体外分离培养条件，为下一步的建系工作奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物6月龄以上日本大耳白兔购自河南省实验动物中心。

1.2 主要试剂H-DMEM干粉培养基、胎牛血清、双抗、非必需氨基酸(NEAA)和Knockout-DMEM购自Gibco公司；FK、4OHT、RA和转铁蛋白和白血病抑制因子(LIF)购自北京索莱宝科技有限公司；Trizol试剂、反转录试剂盒、DNA Maker等购自TaKaRa公司。

1.3 PGCs基础培养液的配制PGCs基础培养液的配制方法详见表1。

表1 PGCs基础培养液的配制

1.4 不同成份PGCs培养液的配置基础培养液标记为A培养液；在A中加入3 μmol/L RA，记为B培养液；在A中加入100 nmol/L 4OHT，记为C培养液；在A中加入20 μmol/L FK，记为D培养液；在A中加入3 μmol/L RA和20 μmol/L FK，记为E培养液；……