舒家武，李熙君，朱力勤，王燕燕

0 引言

三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是一种人表皮生长因子2（human epidermal growth factor receptor 2,HER2）、雌激素受体（estrogen receptor,ER）和孕激素受体（progesterone receptor,PR）均为阴性的乳腺癌。TNBC大约占所有乳腺癌患者的15%～20%，常见于年轻女性，并具有高侵袭、恶性程度高的特点[1]。目前，化疗仍然是治疗TNBC的主要手段。虽然在治疗前期，传统的化疗有效，但TNBC恶性程度高，与其他亚型相比更易复发和死亡，4年内的复发率超过70%[2]。因此，寻找TNBC的治疗手段意义重大。

Long non-coding RNA（LncRNA）是一种长度大于200个核苷酸、不具有编码蛋白质功能的RNA，它们参与着细胞增殖、分化、染色体重塑、表观遗传调控、转录及转录后调控等过程[3]。研究发现LncRNA在乳腺癌、结肠癌、前列腺癌等肿瘤细胞的生长、耐药及上皮间质转化（epithelial-tomesenchymal transition,EMT）等过程中起着重要作用[4]。LncRNA WT1-AS是Wilm’s肿瘤基因的翻译转录物，编码锌指结构域，同时具有致癌与抑癌作用[5]，它的表达量与肝癌患者的生存期呈正相关[6]，而与早期宫颈癌患者生存呈负相关[7]。有研究发现WT1-AS在TNBC中表达显著上调[8]。但目前关于WT1-AS在TNBC中的研究仍较少，本文通过检测WT1-AS在TNBC细胞中的表达，探讨WT1-AS对TNBC细胞侵袭、迁移的影响，探讨其在TNBC发生发展的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

人乳腺上皮细胞MCF-10A和人乳腺癌细胞MDA-MB-231、MDA-MB-453、MDA-MB-468购自北京协和细胞资源中心；DMEM/F12和L15培养基购自美国Hyclone公司；马血清购自上海Solarbio公司；胎牛血清购自美国Gibco公司；胰蛋白酶、BCA蛋白浓度测定试剂盒、RIPA裂解液、5×上样缓冲液、RNA提取试剂和反转录试剂、嘌呤霉素及ECL超敏发光液购自上海Solarbio公司；Lipofectamine RNAiMAX和SYBR Select Master Mix试剂盒购自美国ThermoFisher Scientific公司；shRNA-WT1-AS购自上海RealGene公司；引物购自上海英潍捷基公司；E-cadherin鼠单克隆抗体、N-cadherin鼠单克隆抗体、Vimentin鼠单克隆抗体、Snail鼠单克隆抗体、GAPDH鼠单克隆抗体和HRP标记抗鼠抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；其余试剂均为国产分析纯试剂，购自中国国药集团化学试剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与慢病毒感染 人乳腺上皮细胞MCF-10A使用含5%热灭活马血清、10 μg/ml胰岛素、20 ng/ml EGF、100 ng/ml霍乱毒素和0.5 μg/ml氢化可的松DMEM/F12培养基于37℃、5%CO2培养箱中培养，每隔两天更换培养基。

人乳腺癌细胞MDA-MB-231、MDA-MB-453和MDA-MB-468使用含有10%热灭活胎牛血清（FBS）的L15培养基于37℃，无CO2培养箱中培养，每隔两天更换培养基。

使用10cm的培养皿培养细胞，当融合至50%～60%后进行转染。使用Lipofectamine RNAiMAX将WT1-AS转染至MDA-MB-231细胞。感染后培养4周，换成含嘌呤霉素（1.5 μg/ml）的培养基继续培养两周，每3天更换含嘌呤霉素的培养基获得慢病毒感染且稳定敲除WS1-AS的MDAMB-231细胞株。

1.2.2 实时荧光定量PCR（qRT-PCR） 参照说明书利用TRIzol提取细胞总RNA，用反转录试剂盒进行反转录得到cDNA。然后利用SYBR Select Master Mix试剂盒在ABI 7900仪器上进行qRT-PCR实验。采用2-ΔΔCt计算基因相对表达量。引物序列：WT1-AS:5’-GCCTCTCTGTCCTCTTCTTTGT-3’（正义引物），长度22 bp，5’-GCTGTGAGTCCTGGTGCTTAG-3’（反义引物），长度21 bp；GAPDH:5’-GCTCTCTGCTCCTCCTGTTC-3’（正义引物），长度20 bp，5’-ACGACCAAATCCGTTGACTC3’（反义引物），长度20 bp。

1.2.3 划痕实验 将对数生长期的MDA-MB-231细胞接种至6孔板，培养24 h后用200 μl枪头划痕，然后用0.01 mol/L PBS冲洗3次，并更换为含有1%血清的培养基，划痕后0、24 h观察细胞迁移并拍照。迁移率=（宽度0h-宽度24h）/宽度0h×100%。

1.2.4 Transwell实验 将Transwell小室放置24孔板中，小室内膜用Matrigel胶（1:8稀释）80 μl均匀涂抹，37℃孵育30 min使胶凝固。使用无血清培养基稀释肿瘤细胞，将1×105个细胞（100 μl）加入Transwell上室，在下室中加入600 μl含10%FBS的培养基，置于培养箱培养24 h。然后将细胞固定并用结晶紫染色，擦拭去掉内膜的细胞，于镜下拍照并统计细胞数量。

1.2.5 Western blot实验 收集各组的心肌细胞，使用含有蛋白酶抑制剂Cocktail的RIPA裂解液冰上裂解细胞提取总蛋白，通过BCA法测定蛋白浓度，并将蛋白液95℃处理5 min变性。取50 μg蛋白样本行8%SDS-PAGE。湿法转印至PVDF膜上，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，加入E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail和GAPDH抗体4℃过夜。二抗室温孵育1 h，凝胶成像系统采集图像。

1.3 统计学方法

采用GraphPad Prism 8软件进行统计分析。数据用（）表示，组间比较采用Student’st-test检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LncRNA WT1-AS在TNBC细胞MDA-MB-231中的表达

qRT-PCR结果显示，TNBC细胞MDAMB-231、MDA-MB-453、MDA-MB468中LncRNA WT1-AS的表达量显著高于正常乳腺细胞MCF10A（P=0.001、P=0.007、P=0.005），见图1A。转染后MDA-MB-231细胞LncRNA WT1-AS的表达量显著降低（P=0.001），见图1B。

图1 LncRNA WT1-AS在TNBC细胞中的表达Figure 1 Expression of LncRNA WT1-AS in triplenegative breast cancer (TNBC) cells

2.2 LncRNA WT1-AS对MDA-MB-231细胞侵袭能力的影响

Transwell结果显示，在沉默MDA-MB-231细胞LncRNA WT1-AS表达后，穿膜细胞的数量由107±6下降至61±5，差异有统计学意义（P=0.005），见图 2。表明下调LncRNA WT1-AS可以抑制MDA-MB-231细胞侵袭能力。

2.3 LncRNA WT1-AS对MDA-MB-231细胞迁移能力的影响

划痕实验结果表明，沉默MDA-MB-231细胞LncRNA WT1-AS表达后，细胞在24 h时的迁移率显著下降（Vector:（52.0±2.7）%,Si-WT1-AS:（35.6±2.9）%;P=0.002），见图3。表明下调LncRNA WT1-AS可以抑制MDA-MB-231细胞迁移能力。

2.4 LncRNA WT1-AS对MDA-MB-231细胞EMT的影响

Western blot结果显示，沉默MDA-MB-231细胞LncRNA WT1-AS表达后，E-cadherin表达量显著上调（P=0.000），N-cadherin、Vimentin和Snail表达量显著下调（P=0.000），见图4。说明下调LncRNA WT1-AS抑制了MDA-MB-231细胞的EMT能力。

图2 Transwell实验检测LncRNA WT1-AS对MDAMB-231细胞侵袭能力的影响 (×200)Figure 2 Effect of LncRNA WT1-AS on invasion ability of MDA-MB-231 cells detected by Transwell assay (×200)

图3 划痕实验检测LncRNA WT1-AS对MDA-MB-231细胞侵袭能力的影响（×100）Figure 3 Effect of LncRNA WT1-AS on invasion ability of MDA-MB-231 cells detected by wound healing assay (×100)

3 讨论

图4 Western blot检测LncRNA WT1-AS对MDA-MB-231细胞E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和Snail表达的影响Figure 4 Effect of LncRNA WT1-AS on E-cadherin,N-cadherin,Vimentin and Snail expression in MDAMB-231 cells detected by Western blot

TNBC是乳腺癌中预后最差的亚型，其中位生存期很少超过18月[9]。只有30%～45%的TNBC患者可以达到与其他乳腺癌亚型相同的病理完全缓解和生存率[10]。目前，仍然没有有效的靶点治疗TNBC。LncRNA在肿瘤的发生发展中扮演着重要作用。众多LncRNA在肿瘤中发生失调，它们可能是治疗肿瘤的潜在靶点[3]。研究发现，WT1-AS在人胃癌组织中表达下调，过表达后胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭受到抑制[11-12]。此外，过表达WT1-AS抑制了宫颈癌细胞的凋亡、迁移、侵袭[12]。目前关于WT1-AS在TNBC中的表达及其发生发展中的作用未见报道。我们检测发现WT1-AS在MDAMB-231、MDA-MB-453及MDA-MB-468等TNBC细胞中表达升高。沉默WT1-AS后，通过Transwell和划痕实验发现，MDA-MB-231细胞的侵袭和迁移能力受到抑制。这说明WT1-AS具有促进TNBC细胞MDA-MB-231侵袭与迁移的能力。

EMT是一种高度保守的细胞程序，调控极化上皮细胞转化为可运动的间质细胞，在肿瘤发生发展过程中，细胞间的黏附性降低，极性丧失，基质重塑。EMT与肿瘤的发生、恶性进展、肿瘤干细胞、迁移、肿瘤细胞进入血循环、侵袭及药物抵抗相关[12]。E-cadherin、N-cadherin是跨膜黏附糖蛋白，EMT的进程中出现上皮细胞标志物E-cadherin表达降低，间质细胞标志物N-cadherin表达上调，此外，Vimentin和Snail亦是EMT发生的两个标志物[13]。本研究发现，沉默WT1-AS后，E-cadherin表达上调，N-cadherin、Vimentin和Snail表达下调。说明沉默WT1-AS逆转了MDA-MB-231细胞EMT的过程。

综上所述，本研究发现WT1-AS在TNBC细胞的侵袭迁移过程中发挥着重要作用，并发现WT1-AS通过调控EMT促进TNBC细胞的侵袭迁移。这提示了调控WT1-AS也许是治疗TNBC可能的手段之一，但其具体机制仍需要进一步研究。