唐 慧，白 雪，李双阳

(1.西南医科大学，四川 泸州 646000；2.西南医科大学附属中医医院，四川 泸州 646000)

血管性痴呆(Vascular dementia，VaD)是一类由于脑血管损伤引起的进行性神经退行性疾病，其影响记忆和认知能力[1]。该病机制复杂，临床表现多样，病程进展缓慢，患病人数不断增加，是老年性痴呆最常见的病因之一[2]。VaD是可逆的，早期预防和治疗可减轻患者痛苦，预防疾病发展[3]。目前，VaD的发病机制尚不完全清楚，慢性脑灌注不足是VaD的重要病因，突触可塑性损伤在VaD发病机制中的作用日益受到关注[4]。突触可塑性损伤是参与脑血管病介导出现认知障碍导致VaD的主要环节。突触膜上存在着NMDA受体和AMPA受体，这些受体被激活后，蛋白磷酸化增强，促使Ca2+大量流入突触后神经元产生突触后电位，诱导脑区长时程增强(Long term potentiation，LTP)；而神经元内CREB的磷酸化通过表达调控BDNF因子的过程对突触形成、突触膜上氨基酸受体的活动紧密相关[5]。因各种因素致慢性脑缺血发生，大脑内部供能不良，引起NMDA受体介导的Ca2+内向活动过多，细胞内Ca2+浓度过高，则造成细胞死亡致迟发性神经变性，突触丢失，是VaD发病的机制之一[6]。因此，在继承名中医王明杰教授玄府理论学说的基础上，课题组提出：痴呆之为病，是脑玄府郁闭也，当治以重风药之功，开通玄府、复聪用神[7]。既往研究已表明：风药组方可保护脑灌注不足后导致的海马细胞凋亡，增加海马突触数量，缩短增宽的突触间隙，使突触后致密区染色加深、活性区变长，具有恢复突触的正常结构及提高突触传递效能的作用[8]，但其具体病理机制仍不清楚。因此，本实验通过诱导VaD大鼠模型，研究风药组方对VaD大鼠模型行为学、海马pCREB、BDNF及突触膜上兴奋性氨基酸受体亚基蛋白表达的影响，从脑玄府-突触角度探讨风药组方治疗VaD大鼠的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

60只250～300 g的健康雄性Sprague-Dawley成年大鼠，购自西南医科大学实验动物中心(生产和使用许可证：SCXK(川)019-17；SCXK(川)019-065)，所有大鼠均按照5只/笼分笼饲养，房间安静，在恒温(25±2)℃、湿度50%～55%、光/暗循环12 h的受控环境中饲养，食物和水均自由获取。

1.2 实验药物

通窍益智颗粒：麻黄6 g(产地新疆)、川葛15 g、黄芪30 g(产于甘肃)、地龙10 g(产地广东)、水蛭3 g(产地河北)等)，使用中药材均由西南医科大学附属中医医院中药房提供，且经该院主任中药师鉴定均为正品。制法：地龙、水蛭先经70%乙醇浸泡1周后提取，石菖蒲则提取挥发油，然后所有药材一同水煎3次，过滤残渣，浓缩，制备成2 g/mL浓缩液。尼莫地平(30 mg/片)(批号H0003010)，灌胃前配制成2 mg/mL的溶液。

1.3 主要试剂与仪器

试剂：RIPA组织裂解液(Solarbio，R0010)；鸡尾酒片(Roche，0589791001)；Marker(ThermoFisher，6616)；牛血清白蛋白BSA(博士德，A800-5g)；Anti-pCREB(9198)、Anti-GluN1(5704)、Anti-GluNB(14544)、Anti-GluA (13607S)以及Anti-β-actin(4970)，均购自Cell Signaling Technology；Anti-BDNF(Abcam，ab108319)；WB、IHC通用型二抗(羊抗兔IgG抗体，天津三箭，LK 001)；BCA试剂盒(碧云天，P0010S)；发光液ECL(wandao，PE001+PE002)。

仪器：瑞士METTLER TOLEDOML-T电子天平；成都泰盟Morris水迷宫；德国Leica RM2016石蜡切片机；日本Olympus Inc：BX52显微镜、DP70图像采集系统；瑞士KINEMETICA POLYTRON®机械组织匀浆机；德国Eppendorf 5424台式高速低温离心机；美国Bio-Rad ChemiDocTMXRS+ System凝胶成像分析仪。

1.4 动物分组、造模与给药

术前大鼠随机分为：手术组和假手术组。手术组：采取2-VO法[9]制备VaD大鼠模型；假手术组：给予相同手术方式，但未结扎。造模后予以肌肉注射青霉素钠80 000 IU/d，连续3 d。术后28 d以Morris水迷宫试验(MWMT)测试大鼠的潜伏逃避期(escape latency，EL)，然后挑选出建模合格的大鼠，共50只，随机分为模型组、尼莫地平组(6.25 mg·kg-1·d-1)、通窍益智颗粒高(24.8 g·kg-1·d-1)、中(12.4 g·kg-1·d-1)、低剂量组(6.2 g·kg-1·d-1)，每组10只，中药组每天分别给予12.4 mL/kg、6.2 mL/kg、3.1 mL/kg，溶解尼莫地平片后以2 mL/kg的剂量给药，假手术组和模型组则给予等体积双蒸水，共计灌饲30 d。

1.5 标本采集

停止灌胃后，使用MWMT评估不同组大鼠认知能力，完成后，术前12 h禁食，将大鼠腹腔注射麻醉(4%水合氯醛)，仰卧位固定于操作台，剪开膈肌，暴露心脏，切开心脏右心耳，用注射针尖从心室进入升主动脉后立即注入100～200 mL的0.9%氯化钠，待流出液体变淡，肺组织变白，肝组织呈浅褐色结束，立即断颈取脑，冰中分离左右海马并放入预先编号的组织管内，置液氮速冻备用。进行组化检测的大鼠在0.9%氯化钠灌流后，再以4%多聚甲醛溶液注入至大鼠抖动变僵，迅速取出全脑组织，装入含有4%多甲溶液的EP管内。

1.6 指标检测方法

1.6.1 Morris水迷宫评价行为学改变 ①定位航行实验：本次实验在第Ⅲ象限设置平台，在水中加入适量二氧化钛，将大鼠依次从第Ⅰ到Ⅳ区域象限面向壁侧放入水中，大鼠在90 s内到达平台并停留大于3s即停止录像，该过程所耗的时间即潜伏逃避期(EL)。若在设定时间内找不到平台，则引至平台停留30 s，记EL为120 s。每只大鼠每日不同4个时间点进行训练，连续5天，记录第5天的EL。②空间探索实验：第6天则移去隐藏平台，将大鼠释放到任意一个区域，在120 s内记录大鼠在目标范围游泳时间的长短及围绕原设置平台游的次数，每天1次，连续2 d。

1.6.2 免疫组化检测海马CA1神经元BDNF表达 将全脑组织取出，常规法石蜡包埋，用切片机将标本切出厚度为3～5 μm的切片，贴附于载片上，经脱水、脱蜡操作后，在0.01 mol/L枸橼酸钠液中进行高压抗原提取，然后封闭，第一第二抗体孵育后染色，再进行苏木精复染，冲洗，封片，通过选取切片同一区域的3个不重叠视野，在显微镜400倍数下观察图像。最后用Image J软件分析图像，计算蛋白的表达量。

1.6.3 Western Blot检测pCREB和GluN1、GluN2B、GluA2的表达 海马组织在低温RIPA缓冲液中匀浆，提取蛋白，BCA法测蛋白水平，蛋白质样品与上样缓冲液按比例混合后煮沸冷却，采用SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，并湿转法转到PVDF膜上，膜以5%BSA封闭，并与第一抗体在4 ℃孵育过夜：抗pCREB(800x)，抗GluN1、抗GluNB、抗GluA (1 000x)，随后与第二抗体孵育。用ECL试剂在成像系统中观察蛋白条带。利用Image Lab软件进行靶蛋白条带密度测定。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠行为学的变化

表1显示，假手术组、模型组和药物治疗组的EL呈缩短趋势，各手术组与假手术组相比显示出了明显的记忆差距，其EL明显延长(P<0.05)，各药物治疗组的EL均明显优于模型组(P<0.05)，以通窍益智颗粒24.8 g/kg组变化最为显著(P<0.05)。在第6天后，模型组、药物治疗组在隐藏平台及第Ⅲ象限活动的时间及次数较假手术组不同程度减少(P<0.05)。治疗后，各药物组越过平台次数及第Ⅲ象限游泳时间均有所增长(P<0.05)，以上改变以通窍益智颗粒24.8 g/kg组最为显著(P<0.05)。

2.2 各组大鼠海马神经元CA1 BDNF的表达

结果显示，BDNF在神经元细胞内(主要在胞浆内)表现出呈棕黄色或棕褐色沉淀(图1)；与假手术组比较，BDNF的阳性区域面积在各组间有显著差异，阳性区域面积明显降低(P<0.05)。而药物治疗组的BDNF表达量明显多于模型组(P<0.05)；其中以通窍益智颗粒24.8 g/kg组升高最为显著(P<0.05)。

2.3 各组大鼠海马pCREB和突触GluN1、GluN2B、GluA2的表达

通过Western Blot检测海马区兴奋性谷氨酸受体亚基pCREB、GluN1、GluN2B和GluA2发现，未经给药的VaD大鼠海马pCREB、GluN1、GluN2B和GluA2蛋白表达量显著减少(P<0.05)，而经药物治疗后的VaD大鼠，则逆转了海马pCREB及上述3个受体亚基蛋白表达，显示出上调趋势(P<0.05)。其中通窍益智颗粒24.8g/kg组pCREB、GluN1、GluN2B、GluA2的表达水平高于其余各给药组(P<0.05)。详见表3。

表2 通窍益智颗粒对VaD大鼠海马CA1 BDNF表达的影响

A.假手术组；B.模型组；C.阳性对照组；D.中药高剂量组；E.中药中剂量组；F.中药低剂量组

表3 通窍益智颗粒对VaD大鼠海马pCREB、GluN1、GluN2B、GluA2表达的影响

图2 通窍益智颗粒对VaD大鼠海马神经元pCREB、GluN1、GluN2B、GluA2蛋白表达情况

3 讨论

脑部活动的良好运行需要有充足而连续的血供维持，而其中大量的能量用于大脑皮质神经元触发突触离子泵并使其耗散的离子浓度梯度恢复活动，同时一些神经细胞如星形胶质细胞、少突胶质细胞也与脑血管存在相互代谢相互调节与依赖的状态[10]。大多脑血管病变如动脉粥样硬化，或心源性因素(心脏骤停、血流动力学所致的心律失常等)，以及其他因素导致的小血管堵塞、微出血、低灌注，都可不同程度地导致认知功能障碍[11]。传统中医理论认为，痴呆的发病分虚实两端，或精亏髓减，脑失所养；或邪犯清窍，元神失用[12]，以肾虚为本，夹以痰、瘀、火、毒等实邪，组方大多专注于益肾填髓、化瘀通络、清火祛痰、补脾益气、解毒开窍等角度。

气动则神机转。气是宇宙万物之本原，维系生命活动与自然界之间的物质、信息、能量交换活动，是构成人体生命活动运动不息、至微至细的物质。正所谓“气和而生，津液相成，神乃滋生”，可看出有气的基础后才有“神”的产生，形为神体，神为体用，二者互为体用，借助于气、血、津液的运行，神机才能体现。而我们禀受于父母的先天之精气、呼吸自然界之清气及中焦化生之精气构成了人体之气的来源；物质能为生理机能产生源源不断的能量，如ATP能量的产生依赖于有机物的三羧酸循环，因此，气与现代医学中的能量具极大相似性[13]。

在调控LTP的活动中，cAMP/PKA-CREB通路发挥着重大作用。CREB激活后，NMDA受体引发的LTP活动进一步增强，并触发更多的沉默突触产生，为功能性突触的修饰与产生提供物质基础[17，18]，进而对突触可塑性和记忆方面提供有利条件。BDNF为CERB下游的靶基因之一，其磷酸化调控BDNF表达，在突触活动中，可通过上调下游蛋白结合稳定细胞骨架，抑制内收蛋白失活，促进突触活动发挥神经保护作用[19]。同时，BDNF参与NMDA 和AMPA受体亚基蛋白的表达，影响突触后活动的过程，提高其传递效率与功能[19-20]。此外，BDNF与树突部位的TrkB受体结合可将PSD-95运输至其他树突处以刺激突触的形成[21]。

当脑部血供减少后，cAMP/PKA-CREB信号通路开始发生变化：第一，cAMP的合成下降，随之相关的PKA、CREB及BDNF等关键基因蛋白下调，使LTP活动减弱。其次，由于大脑神经元对缺血缺氧的环境有极大敏感性，脑缺血发生后的短时间内，海马神经元和突触均出现不可逆损伤，海马神经元细胞凋亡，胞内线粒体、核糖体等数量降低，加上灌注不足带来的一系列如氧化应激、炎症等反应更进一步导致神经元损伤，致使突触损坏，从而使海马记忆功能受损[22]。而前文谈到，神机交互需依赖于脑玄府对气血的正常运行[23]。玄府通阖功能有常，气血畅通，邪无所留，神机运转灵活；而当玄府失利，气血运行受阻，一则神机失去物质基础无以化生，二则神机交互失所，神机失用，故表现为呆症[23-24]。玄府功能的维系也需气血的渗养，气血通行不畅，不能灌养玄府而致其功能衰退，正所谓“正虚之处，便是容邪之所”，与传统中医理论中痴呆本虚标实的病机特点不谋而合。因此脑玄府功能郁闭为呆病发生的关键病理病机。

基于对VaD的病机认识，课题组认为，痴呆的治疗之本则在于开通脑之玄府。而风药是有效的一类开通药物，取麻黄、葛根等药物“风”的发散透畅、百变善行之性，载诸药上行，上达头之巅，主诸身之上下、内外，鼓一身之气血、转运神机之用。因玄府自身功能的维持需气血渗溉，故臣以补气药，促进脏腑功能，宣畅气机，达补虚攻邪之功。气血之运不通，久滞化瘀，瘀则成浊邪，故以虫类药配于组方中，走窜善消，散其瘀浊，助通玄府。玄府开阖有常，气血流畅，神机自得以运化交转。现代药理研究显示，方中石菖蒲、麻黄、葛根等“风药”有效成分，可提高BDNF和NMDA受体表达，改善突触形态结构[25-27]；黄芪中有效成分黄芪甲苷具有调节VaD模型大鼠MOD、白介素1和白介素6的表达，并有使海马CA1区GluN1表达上调的作用[28]；人参皂苷Rb1可促进海马CA3突触核蛋白的表达，恢复CA3-Schaffer-CA1通路中的谷氨酸，进而增加突触后密度-95 (PSD-95)的表达，从而调节记忆功能、突触可塑性和兴奋性传递[29]；虫类药水蛭、地龙对调节血液流变学、改善微循环具有一定作用[30-31]。且课题组前期研究显示，风药复方除改善VaD大鼠海马突触形态学[8]，还可通过减轻氧化应激、保护线粒体[32-33]、维持中枢神经递质平衡[34]、提高海马神经元cAMP、PKA表达并减轻凋亡(成果未发表)等途径促进VaD大鼠学习记忆障碍的改善。

综上所述，慢性脑灌注不足可以导致海马神经元突触损伤，而pCREB、BDNF和GluN1、GluN2B及GluA2的表达与突触结构及传递效能密切相关。本研究显示，在方中重用风药麻黄、葛根寓以开通玄府的中药复方，可显著提高大鼠海马神经元pCREB、BDNF的表达，使海马突触兴奋性氨基酸受体亚基GluN1、GluN2B和GluA2的蛋白表达增加，减轻缺血缺氧后海马突触的损伤，从而改善其学习和记忆障碍。同时，从本次实验中给予的中药治疗剂量范畴可以得出，其剂量与疗效具有正向依赖性。