人PBMC 中免疫蛋白酶体亚基LMP7 酶活力的检测

2021-04-08成彦凌春莹罗亚鸽陈宝龙孙瑞

系统医学 2021年2期

关键词：检测

成彦，凌春莹，罗亚鸽，陈宝龙，孙瑞

河南省洛阳正骨医院（河南省骨科医院）生化研究室，河南洛阳 471000

免疫蛋白酶体是一种具有多相催化活性的蛋白酶复合体，它广泛存在于血源性细胞，尤其是淋巴细胞和单核细胞中，并直接参与了免疫系统的运作，在抗原呈递、免疫应答等过程中扮演关键角色[1-4]。免疫蛋白酶体亚基LMP7 在多种自身免疫性疾病中被认定为重要的自身抗原，针对它们的自身免疫反应可能与炎症反应相关[5]。免疫蛋白酶体促进Th 细胞分化，RA 细胞模型中，LMP7 受抑制可导致90% IL-23 的产生受抑制，及 50% TNF-α 和 IL-6 受抑制；抑制LMP7 活性，可缓解类风湿性关节炎小鼠模型病情[6]，提示LMP7 与RA 存在一定联系，其表达、活性极有可能参与了RA 的发生、发展，但目前此方面研究较少。

迄今，有关人PBMC 中LMP7 酶活力的测定方法尚未见报道。该研究拟在荧光法的基础上，采用单因素实验法对LMP7 活性测定条件进行优化，确定人PBMC 中LMP7 酶活力测定的最优化条件，以LMP7酶活力为依据，为进一步探究其在RA 发生、发展中的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试剂

荧光多肽底物 Ac-ANW-AMC、DMSO、Ficoll-Paque、无菌 PBS pH 7.2～7.4，其它试剂为分析纯。

底物溶液配制：荧光多肽底物Ac-ANW-AMC，底物原包装2 mg，轻微离心，加入169.8 μL DMSO 制成20 mM 底物母液，分装并储存于-20℃。使用时，用DMSO 稀释为2 mM 工作液。

反应缓冲液：pH 8.0 Tris-HCl 50 mM，NaCl 150 mM，Glycerol 10%，SDS 0.01% (w/v)[11]。

1.2 仪器

多功能酶标仪（Spectramax i3x MD）；高速冷冻离心机（5804R Eppendorf）；分析天平（XS205 METTLER-TOLEDO）；pH 仪（S220 METTLER-TOLEDO）；超纯水仪（EASYPure II Barnstead）；超净工作台（SWCJ-1FD 苏州安泰）。