李超强，朱凯欣，黄美燕，徐军发

中山大学附属东华医院：1.生殖医学科；2.检验科，广东东莞 523110；3.广东医科大学检验医学研究所，广东东莞 523808

慢性肾脏病(CKD)是临床常见病之一，2010年我国CKD患病率超过10.8%[1]。CKD病理表现为肾小球、肾小管炎性物质浸润及内皮细胞、系膜细胞不良增生，导致肾组织萎缩和纤维化。研究显示，CKD患者血液中白细胞介素(IL)-6、IL-8和胎盘转化生长因子(TGF)等细胞因子异常表达[2-3]。IL-37是一种新型细胞因子，在多种炎症疾病患者血浆中检出水平升高。笔者前期研究发现CKD患者血浆IL-37水平升高，有效治疗后血浆IL-37水平降低[4]。但IL-37在CKD中的作用机制不明确，本研究通过检测CKD患者外周血单核细胞内IL-37水平，并分析血液相关指标，进一步探讨IL-37在CKD中的作用机制及临床意义。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2016年9月至2018年12月中山大学附属东华医院确诊的36例CKD患者作为CKD组，其诊断和分期标准依据2014年慢性肾脏病指南[5]，患者入院前未接受过治疗，未合并糖尿病、肝炎、肺结核、人类免疫缺陷病毒(HIV)感染及自身免疫性疾病。选取来自中山大学附属东华医院健康体检科的22例健康志愿者作为对照组。CKD组中，男20例，女16例；年龄(47.92±14.15)岁。对照组中，男12例，女10例；年龄(41.50±10.77)岁。两组年龄、性别比例比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。将经药物或血液透析等治疗大于10 d的18例CKD患者进行治疗前后的比较。所有研究对象均知情同意并签署知情同意书。本研究通过中山大学附属东华医院医学伦理委员会批准。

1.2仪器与试剂 人淋巴细胞分离液(天津市灏洋生物制品科技有限公司)，1640基础培养基(美国Gibco公司)，IL-37检测试剂(美国BD公司)，尿酸(UREA)、尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)试剂盒(德国罗氏公司)，胱抑素C(Cys-C)试剂盒(广州科方生物技术股份有限公司)；流式细胞仪(美国BD公司)，高速冷冻离心机(美国Thermo公司)，迈瑞5180全自动血液分析仪(中国迈瑞公司)，COBAS C501全自动生化分析仪(德国罗氏公司)。

1.3血常规和C反应蛋白(CRP)水平检测 采集乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝血3 mL，按照迈瑞5180全自动血液分析仪的操作方法进行相应血常规指标和CRP水平检测。

1.4肾功能指标检测 采集肝素抗凝血3 mL，分离出血清，按照COBAS C501全自动生化分析仪的操作方法进行BUN、CREA、UREA和Cys-C水平检测。

1.5外周血单核细胞内IL-37水平检测

1.5.1外周血单核细胞分离 采集EDTA-K2抗凝血10 mL，300×g离心5 min，去血浆留血细胞沉淀。用等量无菌1×磷酸缓冲盐溶液(PBS)稀释血细胞沉淀并混匀，在15 mL离心管中，于人淋巴细胞分离液的液面上方沿管壁缓慢加入等量血细胞悬液，300×g离心20 min。用无菌吸管吸取白膜层加入含10%1640培养基1×PBS中，计数后，取1×106个细胞于两管流式上样管中，300×g离心5 min，弃上清液，染色后作流式细胞分析。

1.5.2单核细胞内IL-37水平检测 按IL-37流式细胞试剂盒的操作方法进行，上机检测后，根据单核细胞在流式细胞仪中的前向散射(FSC)及侧向散射(SSC)散点图的特征，进行单核细胞的设门，记录标本单核细胞内IL-37水平。

2 结 果

2.1外周血单核细胞内IL-37水平及其他指标情况 CKD组外周血单核细胞内IL-37水平明显高于对照组，差异有统计学意义(t=7.147，P<0.05)。CKD组血液中性粒细胞数(NE#)，单核细胞数(MO#)，血清CRP，BUN，CREA、UREA和Cys-C水平均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；两组淋巴细胞数(LY#)比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 CKD组与对照组外周血单核细胞内IL-37水平及其他指标的比较[M(P25，P75)]

2.2患者治疗前后血液指标情况 18例患者经治疗大于10 d，平均14.2 d，治疗后组外周血单核细胞内IL-37水平低于治疗前组，差异有统计学意义(P<0.05)。治疗后组BUN、CREA、UREA和CRP水平均低于治疗前组，差异有统计学意义(P<0.05)。治疗后组血清Cys-C水平，血液MO#、NE#、LY#与治疗前比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 治疗前后外周血单核细胞内IL-37水平及其他指标的比较[M(P25，P75)]

2.3患者外周血单核细胞内IL-37水平与其他血液指标的相关性 患者外周血单核细胞内IL-37水平与血液中MO#(r=0.396 4,P<0.05)、NE#(r=0.343 5,P<0.05)及血清CRP水平(r=0.507 6,P<0.05)呈正相关，与LY#，血清BUN、CREA、UREA和Cys-C水平无相关性(P>0.05)。

3 讨 论

CKD是免疫炎性介质参与的自身免疫性疾病，细胞因子生成和激活是疾病形成和发展的重要基础。研究显示，IL-1、IL-6、IL-8、IL-17、转化生长因子-β(TGF-β)、人胰岛素生长因子1(IGF-1)、血浆内皮素1(ET-1)和内核因子-κB(NF-κB)等细胞因子异常分泌，可活化酪氨酸蛋白激酶(JAK)及信号转导子和转录激活子(STAT)信号途径，刺激肾组织内皮细胞、系膜细胞分泌单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等，加重肾组织炎性反应[6-7]。IL-8和IL-17还可直接诱导大量中性粒细胞和T细胞浸润肾小球，加重肾组织局部炎症和免疫损伤[8]。TGF-β可上调Smad7蛋白，激活NF-κB，诱导足细胞凋亡；也可促进Ⅰ型胶原合成，直接诱导肾脏组织纤维化[9]。ET-1、TGF-β和IGF-1可作用于肾组织，使肾系膜细胞增生、细胞外基质堆积，肾小球动脉硬化，引起水钠潴留，造成水肿、高血压等临床症状[10-11]。因此，多细胞因子多途径参与了CKD的发生与发展。

本研究结果显示，CKD患者外周血单核细胞内IL-37水平明显升高，经药物或血液透析治疗后单核细胞内IL-37水平下降，与CKD患者血浆IL-37水平的研究结果相似[4]。提示血浆IL-37与单核细胞内IL-37有密切关系，血浆IL-37或来源于单核细胞[12]，且血浆和单核细胞中的IL-37均参与CKD的发生、发展。IL-37在CKD中的机制可能为：可通过抑制Toll样受体激动剂，减少肾脏IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α等炎性细胞因子产生[13]；也可通过抑制NLRP3炎性小体的激活，影响炎性细胞的募集和Th1/Th2平衡[14]；与IL-18Rα链非竞争性地形成复合体，抑制NF-κB、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)等途径，使得γ-干扰素(IFN-γ)的合成下调，抑制树突状细胞活性，从而延缓抗原提呈过程，抑制其免疫应答[15]。此外，成熟的IL-37还可以进入细胞核与Smad3蛋白结合，形成复合体，调节基因转录来抑制促炎因子的产生。总之，IL-37可通过抑制促炎因子表达、阻断信号转导、诱导抑炎因子表达等途径抑制炎症。因此，IL-37检测是评估CKD治疗效果的辅助性指标。

血清中BUN、CREA、UREA和Cys-C联合检测能有效反映患者肾功能状况，是患者药物治疗或血液透析后常规检测的生化指标。本文跟踪检测18例患者，结果显示，患者经药物或血液透析后，外周血单核细胞内IL-37，血清BUN、CREA、UREA水平呈不同程度的降低，但血清Cys-C水平、血液MO#、LY#、NE#变化不明显。这提示外周血单核细胞内IL-37水平降低与肾功能改善相关。本研究结果也显示，CKD患者外周血单核细胞内IL-37水平与肾功能指标中BUN、CREA、UREA、Cys-C无相关性，这提示外周血单核细胞内IL-37水平与CKD进展不一定呈正相关，与之前研究结果相似[4]。可能原因为跟踪例数少，没有对CKD的分期进行分析，但是随着CKD向终末期进展，机体并发症增多，自身免疫应答更紊乱，刺激IL-37表达的机制和途径也更复杂。

外周血中性粒细胞、单核细胞及淋巴细胞在炎性疾病中扮演着重要角色。炎性反应会使外周血NE#、MO#和LY#不同程度地升高，参与抵抗病原侵入、吞噬异物、杀灭病菌等，并释放大量趋化因子、IL-1、IL-6、TNF-α等。CRP是急性时相反应蛋白，在机体发生炎症或感染后，血浆CRP水平会升高，而且在急性、亚急性与慢性病理状态下，CRP有不同特征性的改变[16]。CKD是一个慢性炎性过程，患者体内炎性介质的持续存在和炎性反应刺激体内NE#、MO#和LY#反应性增多，参与肾组织的免疫防御，以阻止或延缓固有免疫及适应性免疫细胞的免疫应答[14]。在相关性分析中，CKD患者血液NE#、MO#及血清CRP水平与单核细胞内IL-37水平呈正相关。提示IL-37与炎性细胞水平密切相关。此外，本研究发现CKD患者血液中LY#略有升高，可能提示淋巴细胞更多转化为T细胞、B细胞和NK细胞，具有免疫性杀伤作用。抑炎因子IL-37、炎性细胞、炎性因子等不断作用于肾脏组织，最终造成肾组织的免疫损伤及CKD形成。

综上所述，CKD患者外周血单核细胞内IL-37水平升高，与血液MO#、NE#及血清CRP水平呈正相关。经临床药物或血液透析有效治疗后，CKD患者肾功能改善，外周血单核细胞内IL-37水平下降。