刘惊涛，李知宗，林显光，陈恒玲

(中南民族大学 生物医学工程学院/脑认知国家民委重点实验室/医学信息分析及肿瘤诊疗湖北省重点实验室，武汉 430074)

1 胆囊收缩素A受体与CRISPR/Cas9系统工作原理

1.1 胆囊收缩素A受体

胆囊收缩素(Cholecystokinin，CCK)由肠I细胞分泌，CCK可通过内分泌、旁分泌、自分泌和神经分泌等多种形式调节多种细胞功能[1]。研究提示，CCK可能与糖尿病的发病存在密切关系[1]。在胰岛中，CCK可以通过胆囊收缩素A受体(Cholecystokinin A receptor，CCKAR)来调控胰腺中各个细胞的功能。大量事实证明，CCKAR基因与动物的日采食量和平均日增重有明显关联。Takiguchi通过研究发现，CCKAR基因能维持动物体内的血糖浓度[2]。胆囊收缩素A型受体基因与幻听相关[3]，胆囊收缩素A型受体与人群胆道癌及胆石症易感性有一定关系[4]。

1.2 CRISPR/Cas9系统工作原理

CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)被称为规律成簇间隔短回文重复序列。Cas9是CRISPR相关核酸酶，CRISPR/Cas9是最新出现的一种由gRNA指导的、利用Cas9核酸酶对靶向基因进行编辑的技术。CRISPR系统主要依赖crRNA和tracrRNA来对外源DNA序列进行特异性降解。crRNA通过碱基互补配对，与tracrRNA结合，形成tracr/crRNA复合物。此复合物引导核酸酶Cas9蛋白与crRNA互补配对的序列靶位点剪切双链DNA。CRISPR/Cas9系统由于其突变效率高、制作简单、成本低，被广泛应用于基因组的精确修饰，是一种具有广阔应用前景的基因改造分子工具[5-7]。研究使用的载体为pL-CRISPR.EFS.GFP(载体信息见ADDGENE :57818)。

2 实验部分

2.1 实验材料

BsmbⅠ限制性核酸内切酶(美国Thermo Scientific公司生产)、CCKAR Oligo序列(武汉Tsingke公司生产)、T4 DNA连接酶(武汉淼灵生物公司生产)、pL-CRISPR.EFS.GFP(实验室提供)、5× Annealing buffer(上海Beyotime公司生产)、质粒提取试剂盒……