徐真谛 李润芝 李元宽 杨小生

1 材料与方法

1.2 细胞株 人非小细胞肺癌细胞系A549购自中国科学院。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养:A549细胞用含10%胎牛血清的RPIM 1640培养基置于37℃、5%的CO2孵箱中进行培养。

1.3.2 细胞刺激:A549细胞以5×105个/孔铺于24孔板中，加入10 ng/ml的细胞因子IFN-γ、IL-17A、TNF-α或GM-CSF进行刺激24 h，或加入10 μmol/L的BAY 11-7082(NF-κB抑制剂组)、STAT5-IN-1(STAT5抑制剂组)、AS1517499(STAT6抑制剂组)、Fludarabine(STAT1抑制剂组)、FLLL32(STAT3抑制剂组)或DMSO(与抑制剂中的DMSO含量相当，DMSO组)以及培养基(对照组)预先孵育1 h，然后清洗掉孔中的培养基，再加入新的RPMI 1640培养基，同时利用10 ng/ml 的IFN-γ进行刺激24 h，收集A549细胞，用于PD-L1的水平检测。

1.3.3 流式细胞术:胰酶消化培养的A549细胞，利用无菌PBS清洗2次，然后加入PE标记的抗人PD-L1抗体及相应的同型IgG抗体，于4℃孵育30 min，随后用PBS清洗2次，加入4%的多聚甲醛固定20 min，再用PBS清洗2次后重悬细胞，利用流式细胞仪检测A549细胞表达PD-L1的情况。

1.3.4 外周血单个核细胞的分离:取体检健康人的外周血，用无菌PBS按照1∶1的体积比进行稀释，50 ml离心管中加入淋巴细胞分离液，并将稀释后的血液轻柔的加在淋巴细胞分离液的上层，放入离心机中，以2 000 r/min的速度离心20 min，吸取中间的白膜层细胞即为所需的单个核细胞。

2 结果

2.1 IFN-γ诱导PD-L1表达的检测 体外培养的A549细胞经重组人细胞因子IFN-γ、IL-17A、TNF-α或GM-CSF刺激后，检测PD-L1的表达水平。与同型对照染色比较，PD-L1抗体染色显示未刺激细胞中PD-L1阳性细胞比例为(39.6±5.8)%，提示A549细胞可组成性的表达PD-L1分子；当利用IFN-γ刺激后，可观察到PD-L1阳性细胞比例为(94.3±4.9)%，与未刺激组比较差异有统计学意义(P<0.05)，提示IFN-γ可诱导A549细胞上调表达PD-L1；A549细胞经IL-17A、TNF-α或GM-CSF刺激后，PD-L1阳性的细胞比例分别为(40.5±14.3)%、(43.7±16.1)%和(41.3±10.4)%，与未刺激组比较差异无统计学意义(P>0.05)，提示IL-17A、TNF-α或GM-CSF刺激未能有效改变A549细胞中PD-L1的表达水平。见图1，表1。

图1 流式细胞术……