马腾　刘巧红　林文俐　高爱琴

【摘要】 目的：探討IL-18、IL-10在乳腺癌组织中的表达情况及其与淋巴结转移的相关性。方法：选取2017年11月-2019年6月山东大学附属济南市中心医院经手术切除并经病理确诊的104例乳腺癌组织及31例乳腺纤维腺瘤组织标本，应用免疫组织化学方法检测IL-18和IL-10的表达情况，比较乳腺癌组织及乳腺纤维腺瘤组织中IL-18和IL-10的表达情况;分析IL-18和IL-10表达的相关性;比较有无淋巴结转移的乳腺癌组织中IL-18和IL-10表达的表达情况;比较不同其他临床病理特征的乳腺癌组织中IL-18和IL-10表达情况。结果：乳腺癌组织的多数肿瘤细胞中IL-18表达阳性，其染色部位位于细胞膜及胞浆，呈弥漫性分布。乳腺癌组织中IL-18阳性表达率为75.0%（78/104），高于乳腺纤维腺瘤组织的19.4%（6/31），差异有统计学意义（P<0.001）。乳腺癌组织中多数细胞IL-10呈阳性表达，主要染色位于肿瘤细胞的胞浆。乳腺癌组织IL-10阳性表达率为78.8%（82/104）高于乳腺纤维腺瘤组织的22.6%（7/31）（P<0.001）。乳腺癌组织中IL-18与IL-10的表达呈正相关（r=0.533，P<0.05）。有淋巴结转移的乳腺癌组织中IL-18、IL-10均呈高表达;IL-18的阳性表达率为82.8%（53/64），IL-10的阳性表达率为85.9%（55/64），均高于无淋巴结转移的62.5%（25/40）、67.5%（27/40），差异均有统计学意义（P<0.05）。不同年龄、肿物最大直径、组织学类型、分化程度、临床分期、ER、PR和HER2/neu状态的乳腺癌组织中IL-18、IL-10的表达情况比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。结论：与乳腺纤维腺瘤组织比较，IL-18、IL-10在乳腺癌组织中高表达，且两者的表达呈正相关，均与淋巴结转移具有一定相关性，IL-18与IL-10可能通过相互作用促进乳腺癌进展，两者可作为乳腺癌患者的诊断指标及不良预后标志物。

【关键词】 乳腺癌 IL-18 IL-10 淋巴结转移

[Abstract] Objective： To investigate the expression of IL-18 and IL-10 in breast cancer tissues and their correlation with lymph node metastasis. Method： From November 2017 to June 2019 in Jinan Central Hospital affiliated to Shandong University， 104 cases of breast cancer tissues and 31 cases of breast fibroadenoma tissue samples that were surgically resected and pathologically confirmed were selected to detect the expression of IL-18 and IL-10 by immunohistochemistry. The expressions of IL-18 and IL-10 in breast cancer tissue and breast fibroadenoma tissue were compared. The correlation of IL-18 and IL-10 expression was analyzed. The expressions of IL-18 and IL-10 in breast cancer tissues with or without lymph node metastasis were compared. The expressions of IL-18 and IL-10 in breast cancer tissues with different clinicopathologic features were compared. Result： IL-18 was positively expressed in most tumor cells of breast cancer tissue， and its staining sites were located in the cell membrane and cytoplasm， presenting a diffuse distribution. The positive expression rate of IL-18 in breast cancer tissue was 75.0% （78/104）， which was higher than 19.4% （6/31） in breast fibroadenoma tissue， and the difference was statistically significant （P<0.001）. IL-10 was positively expressed in most cells of breast cancer tissue， and mainly stained in the cytoplasm of tumor cells. The positive expression rate of IL-10 in breast cancer tissues was 78.8% （82/104）， which was higher than 22.6% （7/31） in breast fibroadenoma tissues （P<0.001）. There was a positive correlation between IL-18 and IL-10 expression in breast cancer tissue （r=0.533， P<0.05）. IL-18 and IL-10 were highly expressed in the breast cancer tissues with lymph node metastasis; the positive expression rate of IL-18 was 82.8% （53/64）， and that of IL-10 was 85.9% （55/64）， both of which were higher than 62.5% （25/40） and 67.5% （27/40） in breast cancer tissues without lymph node metastasis， with statistical significance （P<0.05）. There were no statistical significance in the expressions of IL-18 and IL-10 in breast cancer tissues with different ages， maximum tumor diameter， histological type， degree of differentiation， clinical stage， ER， PR and HER2/neu status （P>0.05）. Conclusion： Compared with breast fibroadenoma tissue， IL-18 and IL-10 are highly expressed in breast cancer tissue， and their expressions are positively correlated and correlated with lymph node metastasis. IL-18 and IL-10 may promote the progression of breast cancer through interaction， and both can be used as diagnostic indicators and poor prognostic markers for breast cancer patients.

[Key words] Breast cancer IL-18 IL-10 Lymph node metastasis

First-author’s address： The Fifth People’s Hospital of Ji’nan， Ji’nan 250000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.22.008

乳腺癌是世界上女性发病率最高的恶性肿瘤，约占女性新发癌症病例的15%，严重威胁女性生命健康[1]。尽管近年来手术、放疗、化疗、内分泌治疗和靶向治疗都取得了很大进展，但进展期和晚期转移性乳腺癌患者的预后仍然很差。IL-18是一种多功能的细胞因子[2]，在多种实体肿瘤细胞包括肺转移癌、晚期胃癌和食管癌中过表达，可以促进Th1细胞的细胞毒性作用，后者通过识别杀伤性细胞毒性T细胞（CTL）导致其凋亡增多和攻击力下降，从而促进肿瘤细胞生长。IL-10是经典的免疫抑制性细胞因子[3]，在细胞免疫应答及促炎症因子分泌中发挥极其重要的抑制作用。既往临床研究发现IL-10在胃癌、食管癌及卵巢癌等恶性肿瘤患者血清中表达水平明显高于健康人，可能具有促进肿瘤生长作用[4-6]。但是关于两者在乳腺癌组织中的表达情况及两者之间关系如何，目前鲜有报道。本研究应用免疫组织化学方法检测IL-18与IL-10在乳腺癌患者组织标本中的表达情况及两者的相关性，并分析两者与患者淋巴结转移及其他临床病理特征的关系，旨在探究乳腺癌发生发展的免疫机制，为患者诊断及预后评估提供新的手段，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 标本来源 所有组织标本取自2017年11月-

2019年6月在山东大学附属济南市中心医院普外科行手术切除并经过病理确诊的135例乳腺肿瘤患者，其中104例为乳腺癌患者，年龄28～69岁，平均54.5岁;依据WHO（2003年）组织学分级标准[7]，Ⅰ级23例，Ⅱ级47例，Ⅲ级34例;根据AJCC（2016年）TNM临床分期标准，Ⅰ期23例，Ⅱa期30例，Ⅱb期17例，Ⅲa期19例，Ⅲb期15例。另31例乳腺纤维腺瘤患者作为对照，年龄28～36岁，平均28.4岁。纳入标准：既往无恶性肿瘤病史;术前未行抗肿瘤相关治疗，如新辅助化疗、内分泌治疗、靶向治疗和放疗等;患者的基本资料完整。排除标准：患有血液系统疾病、急慢性感染、甲状腺疾病和其他的良恶性肿瘤。本研究所有標本的取材均经过患者及家属知情同意并通过山东大学附属济南市中心医院伦理委员会批准。

1.2 方法 所有标本经10%福尔马林固定，石蜡包埋，制成4 μm厚薄的切片，常规行HE染色和免疫组织化学染色。

1.2.1 主要试剂及仪器 PBS溶液（pH 7.4;迈新PBS-0060磷酸盐缓冲液粉剂），柠檬酸盐抗原修复缓冲液（pH 6.0;迈新MVS-0066柠檬酸盐缓冲液），浓缩型DAB显色试剂盒（福州迈新生物技术开发有限公司），免疫组织化学Elivision试剂盒（福州迈新生物技术开发有限公司），兔抗人IL-10单克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司），兔抗人IL-18单克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司），显微镜（OLYMPUS），脱水机，包埋机，漂烘处理仪、石蜡切片机及烘片机（德国LEICA），电热恒温水浴箱（北京市医疗设备厂）。

1.2.2 HE染色 将乳腺纤维腺瘤及乳腺癌组织蜡块分别连续切片5张，切片厚4 μm，于60 ℃恒温箱中烤片60 min，将切片经二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ浸泡后分别用100%、95%、85%、75%的梯度酒精依次冲洗，然后给予苏木素和伊红染色，中性树胶封片、晾干，确定标本的组织分化程度。

1.2.3 免疫组化检测 选取石蜡切片标本置60 ℃烤箱烘烤60 min后室温存放，二甲苯脱蜡，梯度酒精依次冲洗，柠檬酸盐抗原修复缓冲液（pH=6.0）对组织抗原进行高压修复（95 ℃，2 min），室温自然冷却，每张切片滴加一抗工作液50 μL，湿盒放入37 ℃水浴箱中孵育90 min，PBS冲洗后滴加二抗，37 ℃孵育20 min，DAB（二氨基联苯胺）显色经苏木素复染、脱水、透明后封片。

1.3 结果判定 每张切片均由两位病理科医生双盲法阅片，计数差10%以上重新计数。DAB显色后以细胞内出现棕黄色或棕黄色颗粒为阳性。结果判断采用半定量积分法，每张切片于200倍镜下随机选择3个视野，根据阳性细胞比例及着色深浅计分，着色细胞<1/3计1分;着色细胞1/3～2/3计2分;>2/3计3分[8]。着色深度：无着色计0分;浅黄色计1分;棕黄色计2分;棕褐色计3分。二者乘积为该组织所得分值。按分值进行评定，≤2分为阴性;≥3分为阳性（3分为弱阳性，4～5分为阳性，6～9分为强阳性）。对于IL-10，染色强度未着色为0分、浅黄色为1分、浅黄色与黄色之间为2分、黄色至棕黄色为3分;阳性细胞比率评分：0为0分、1%～25%为1分、26%～50%为2分、51%～75%为3分、76%～100%为4分;总分=染色强度评分×阳性细胞比率评分;≤2分为阴性;≥3分为阳性。

1.4 统计学处理 结果采用SPSS 22.0统计学软件进行处理。计数资料以率（%）表示，IL-18在人乳腺癌组织中的表达与IL-10及患者临床病理参数之间的关系，采用字2检验和Pearson列联系数分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乳腺癌与乳腺纤维腺瘤组织细胞中IL-18的表达情况 乳腺癌组织的多数肿瘤细胞中IL-18表达阳性，其染色部位位于细胞膜及胞浆，呈弥漫性分布（图1A）;在乳腺纤维腺瘤组织中，多数细胞IL-18呈现阴性表达（图1B）。乳腺癌组织中IL-18阳性表达率为75.0%（78/104），高于乳腺纤维腺瘤组织的19.4%（6/31），差异有统计学意义（P<0.001），见图1C。

2.2 乳腺癌与乳腺纤维腺瘤组织细胞中IL-10的表达情况 乳腺癌组织中多数细胞IL-10呈阳性表达，主要染色位于肿瘤细胞的胞浆（图2A），而乳腺纤维腺瘤组织中，IL-10表达相对较低（图2B）。乳腺癌组织IL-10阳性表达率为78.8%（82/104）高于乳腺纤维腺瘤组织的22.6%（7/31），差异有统计学意义（P<0.001），见图2C。

2.3 IL-18与IL-10在乳腺癌组织中表达的相关性 乳腺癌组织中IL-18与IL-10的表达呈正相关（r=0.533，P<0.05），见图3。

2.4 有无淋巴结转移的乳腺癌组织中IL-18、IL-10的表达情况 有淋巴结转移的乳腺癌组织中IL-18、IL-10均呈高表达（见图4A、D），而在无淋巴结转移的乳腺癌组织中均呈低表达（见图4B、E）。64例淋巴结转移的乳腺癌组织中，IL-18的阳性表达率为82.8%（53/64），IL-10的阳性表达率为85.9%（55/64），均高于无淋巴结转移的62.5%（25/40）、67.5%（27/40），差异均有统计学意义（字2=5.417、5.017，P=0.020、0.025）。见图4C、F。

2.5 不同其他临床病理特征乳腺癌组织中IL-18、IL-10的表达情况比较 不同年龄、肿物最大直径、组织学类型、分化程度、临床分期、ER、PR和HER2/neu状态的乳腺癌组织中IL-18、IL-10的表达情况比较，差异均无统计学意义（P>0.05），见表1。

3 讨论

乳腺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，在女性恶性肿瘤发病率中排名第一[9]。近年来，乳腺癌的发病率和死亡率都呈上升趋势，年龄上也呈现年轻化，严重危害人类健康[10]。虽然目前化疗、放疗、内分泌治疗和靶向治疗等手段取得了较大的进展，但是患者的预后仍不尽如人意。因此，探究乳腺癌发生发展机制及寻找新的治疗策略已成为当今乳腺癌研究的热点。近年来兴起的免疫治疗改变了恶性黑色素瘤、肺癌、头颈部癌和消化道肿瘤等诸多实体肿瘤的治疗模式，是实体肿瘤潜在的治愈性手段。但是在乳腺癌中，除了小部分三阴性乳腺癌患者，免疫治疗并未获得显著的临床获益[11]。因此探寻乳腺癌发生及进展的免疫机制显得尤为重要。

IL-18是多功能的免疫调控细胞因子。研究证实，IL-18能够协同体内其他细胞因子如IL-12或IL-15来调节多种免疫细胞的活性。如IL-18能够与IL-12协同作用活化CD4+/CD8+T细胞及NK细胞，促进其直接的杀伤能力或杀伤性细胞因子IFN-γ的释放[12]。此外，在没有IL-12或IL-15等细胞因子存在时，IL-18可诱导初始T细胞向Th2细胞的分化。目前关于IL-18在恶性肿瘤中的作用仍不甚明了。文献[13]研究显示，IL-18具有较强的免疫调节活性，可以通过诱导干扰素-γ（IFN-γ）的产生发挥抗感染和抗肿瘤等作用。在小鼠成瘤模型中发现，肾癌肿瘤细胞株中IL-18过表达降低了其在同源小鼠中的致瘤活性，抑制了肿瘤的生长速度[14]。既往的临床研究中发现，一些恶性肿瘤患者的血清中IL-18的水平明显升高，并且往往预后较差，在晚期胃癌和食管癌患者血清中IL-18水平显著高于健康人，并且与患者术后存活率呈负相关，与肿瘤的生长和病理分级呈正相关性[15]。同时皮肤癌、肺转移癌、NK细胞淋巴瘤患者血清中也发现了IL-18水平显著升高[16]。本研究发现，IL-18主要表达于乳腺癌肿瘤细胞中，其在乳腺癌组织中阳性表达率高于乳腺纤维腺瘤组织（P<0.05），且和淋巴结转移相关。IL-18在乳腺癌中可能发挥促肿瘤效应，可作为乳腺癌患者的诊断指标及预后不良的标志物，同时可能是乳腺癌治疗的潜在靶点。

IL-10是经典的免疫抑制性細胞因子。研究表明，肿瘤微环境中肿瘤细胞、肿瘤相关巨噬细胞、调节性T细胞等均可释放IL-10，进而抑制Th1细胞中IL-2、TNF-α及INF-γ的产生，抑制T细胞的增殖及杀伤能力[17-19]。因此IL-10在肿瘤细胞中的高表达是患者肿瘤进展的推动因素及预后不良的标志。既往研究发现IL-18可能通过上调NF-κB的表达和活性，进而抑制IL-10的抑肿瘤作用[20]。有趣的是，IL-10同样能够通过NF-κB转录激活IL-18表达。本研究发现，乳腺癌组织中IL-10阳性表达率高于乳腺纤维瘤组织（P<0.05），且IL-10在乳腺癌组织中的表达水平与IL-18呈正相关（P<0.05）。李乔等[21]研究发现卵巢癌患者中的巨噬细胞通过释放IL-10上调肿瘤细胞中乏氧诱导因子1α表达，从而促进癌细胞的侵袭和转移。孙振华等[22]发现，IL-10在甲状腺乳头状癌组织的肿瘤细胞中表达上调，其表达水平与甲状腺乳头状癌的包膜侵犯及淋巴结转移有关。这些研究结果与本研究结果一致，提示IL-10可能与IL-18相互调控，共同促进了乳腺癌的发生、发展及转移等过程，上述结果也从侧面证实两者可能是乳腺癌患者潜在的治疗靶点。

综上所述，与乳腺纤维腺瘤组织比较，IL-18、IL-10在乳腺癌组织中高表达，且两者的表达呈正相关，均与淋巴结转移具有一定相关性，IL-18与IL-10可能通过相互作用促进乳腺癌进展，两者可作为乳腺癌患者的诊断指标及不良预后标志物。但是关于两者的具体调控机制及作用靶点，还需要进一步研究。

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（收稿日期：2020-10-16） （本文编辑：田婧）