朱 亮 林享玉 何 晶

（同济大学医学院病理和病理生理学系，上海 200092）

皮肤作为人体最大的器官，是隔离外界环境的天然屏障。烧伤感染、外科手术及放射性损伤等都可导致皮肤损伤[1]。尤其是大面积皮肤缺损，虽然临床上多采取自体皮肤移植，但供体来源不足及二次损伤等都限制了其应用，而同种异体移植又面临免疫排斥而难以获得更好疗效。干细胞技术和组织工程的飞速发展，为组织器官损伤修复、重构再生提供了更具优势的新途径，成为再生医学领域最具潜力的发展方向之一，也为大面积皮肤缺损的治疗提供了新思路[2]。种子细胞是皮肤组织工程的关键要素之一，而干细胞因增殖能力强、多向分化潜能被认为是理想的种子细胞来源。干细胞包括胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）、诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）和成体干细胞等，其中ESCs 存在伦理学方面的争议，而iPSCs涉及安全性、效率和再分化机制等方面的问题，目前均难以用于临床；成体干细胞是从成体组织中获得，例如脂肪干细胞（adipose tissue-derived stem cells，ASCs）、骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cell，BMSCs）、牙髓干细胞（dental pulp stem cells，DPSCs）等，近年来在再生医学领域开展了大量的研究[3]。其中，ASCs是2001年Zuk等[4]首次从脂肪组织中提取，其具有来源丰富、损伤小、获得量大、增殖能力强且免疫原性低等独特优势，被认为是组织工程理想的种子细胞之一。现主要从ASCs的获取培养、生物学特性及其在皮肤再生及组织工程中的应用及相关研究进展展开论述。

1 ASCs的获取和体外培养

1.1 ASCs的获取、分离

ASCs多通过腹部或臀部等部位抽脂、吸脂术获取。无论是人或者动物，ASCs分离方法和其他间充质干细胞类似，均可通过酶消化法或者非酶促分离法来获得。酶消化法最为常用，主要通过胶原酶消化细胞间的胶原组织，使细胞彼此分离，再经过过滤、洗涤和离心等操作等后获得单细胞状态的ASCs，速度快，但成本稍高。而非酶促分离法包括组织块贴壁法、梯度离心法等。组织块贴壁法存在细胞贴壁难，漂浮在液体中容易在换液过程中丢失；而梯度离心虽然操作简单，但仍有损失大、获得量有限的问题，因此非酶促分离法在实践中较少采用。

1.2 ASCs的纯化

脂肪属于中胚层，类似于骨髓拥有丰富的基质，包含有多种组织成分。酶消化法所获得的是一个混杂的细胞群，又称为血管基质部分（stromal vascular fraction，SVF）。SVF除了具有多向分化能力的ASCs，还含有分化在不同阶段的脂肪系细胞，如成熟的脂肪细胞、前脂肪细胞及脂肪祖细胞等，另外还包括成纤维细胞、周细胞、内皮细胞、内皮祖细胞、血管平滑肌细胞、免疫细胞和造血干细胞等多种细胞成分[5-6]。有研究显示，ASCs作为SVF的干性成分，实际上主要分布在白色脂肪组织中血管周围[7]。而通常人ASCs可通过多次传代培养，逐渐提高ASCs的纯度，干细胞表面标志鉴定显示纯度可达95%以上。也有学者通过免疫磁珠或流式分选等方法进一步纯化ASCs。

1.3 ASCs的体外培养

ASCs的培养方式、培养体系及氧浓度[8]等均是影响ASCs体外培养的重要因素。相较于传统的2D培养，3D培养方式可以促进细胞增殖和特异性蛋白表达[9]。而无血清培养液可以增强ASCs增殖能力，有效减小其倍增时间，并促进其向脂肪和骨的方向分化[10]。低氧环境不但促进ASCs增殖及干性维持[11]，也促进多种可溶性因子的合成和分泌[12]，如血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF），同时有利于血管化[13]。

2 ASCs的生物学特性

2.1 ASCs的分化能力

与BMSCs相似，ASCs在特定的诱导条件下具有分化为脂肪细胞、软骨细胞、骨细胞、内皮细胞、角质细胞、星形胶质细胞、神经细胞、尿路上皮细胞、心肌细胞等的多向分化能力[14-16]。而与BMSCs相较，ASCs具有损伤小、获得量大及异位骨化可能性小的独特优势，使其在临床治疗的应用中具有更大的潜力。同时，供者年龄、组织类型、取材部位、手术方式、培养条件及细胞密度等都可能影响到ASCs的活力、增殖和多向分化能力。

2.2 ASCs的分泌功能

ASCs具有强大的分泌功能，例如其可分泌多种血管生长因子，包括VEGF、胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor-1，IGF-1）、肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）和血管生成素等，有助于血管内皮化及微血管形成。ASCs还可合成及分泌白细胞介素（interleukin，IL）类、集落刺激因子类、干扰素类、趋化因子类等多种生物活性物质[17]，参与脂代谢、食欲及胰岛素敏感性等的调节。同时，ASCs分泌如外泌体等细胞外囊泡，囊泡内带有大量蛋白质、RNA和脂质分子等生物活性物质，参与到周围细胞发育和功能的调节中[18]。

2.3 ASCs的细胞表型

目前分离获取的ASCs经过体外传代培养后可获得纯化，其细胞表面可表达特征性受体和黏附分子[19]。与其他成体间充质干细胞的表型类似，ASCs具有如CD73、CD90、CD105等多种间充质干细胞的特异性表面抗原[20]。

3 ASCs在皮肤组织工程及再生中的应用

3.1 促进皮肤创面愈合

3.1.1 调节炎症反应促进修复 ASCs在创面炎症初期迁移至局部创面部位发挥重要作用[21]。有研究表明，ASCs促进炎症局部血管生成和上皮细胞增殖再生，同时通过促进巨噬细胞等炎性细胞及内皮祖细胞的迁移，从而促使局部创面成纤维细胞增殖迁移和肉芽组织增生调节炎症反应，该作用相比于BMSCs更具优势[22]。ASCs分泌多种生长因子调控成纤维细胞和内皮祖细胞等的生长、分化，促进血管化和胶原合成，为局部创面修复奠定基础。另外，分泌含有蛋白、脂质和RNA等的外泌体也是ASCs参与创面组织的修复和再生的重要作用机制。Li等[23]的研究显示过表达Nrf2的ASCs分泌的外泌体可以有效下调局部创面IL-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等参与炎症反应相关细胞因子的水平，从而有效抑制炎症反应，辅助创面修复。

3.1.2 ASCs促进一般创面愈合 创面愈合是一个涉及上皮形成、新生血管生成以及胶原沉积，并伴有炎症反应的复杂生理过程，其关键因素是局部炎性细胞释放的细胞因子和新血管形成的数量。研究表明，ASCs可通过分泌多种生物因子促进纤维化，旁分泌相关细胞因子加速血管内皮细胞的增殖和血管化[24]，同时ASCs可以减少α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）和I型胶原的含量，改善真皮组织空间结构，从而有效抑制创面愈合过程中的瘢痕形成[25-26]。黄敏等[27]将ASCs联合富血小板纤维蛋白复合物用于治疗小鼠全层皮肤缺损，结果显示可显著提高创面愈合率，并抑制炎症反应。

3.1.3 促进难愈性创面愈合 而临床上一些年老体弱、极度营养不良患者，或者某些具有基础疾病的患者，其皮肤创面的愈合往往非常困难，例如糖尿病足部创面愈合、放射性损伤皮肤创面等。赵月强等[28]通过自体ASCs局部注射的治疗方法，显示实验组创面愈合面积显著高于对照组，创面感染率和平均住院时间显著低于对照组。这主要依赖于ASCs通过增殖分化为不同类型的组织细胞及分泌VEGF、bFGF等促进成纤维细胞和血管内皮细胞的迁移，增加局部毛细血管和侧支循环来促进皮肤愈合[29-30]。另外，Horton等[31]报道ASCs能够通过下调IL-1等促炎因子、增加IL-4等抗炎因子的分泌调节免疫细胞的数量和功能，从而调节炎症反应，这对放射性损伤引起的难愈性创面具有良好的治疗效果[32]。同时ASCs还可以直接分化为表皮细胞，上述生物因子也可促进表皮角化细胞的增殖和迁移，从而加速创面的再上皮化[33]。

3.2 抑制瘢痕疙瘩

瘢痕形成是创面愈合的自然过程，病理性瘢痕是胶原沉积和重塑异常导致真皮细胞外基质产生过多及降解不足从而形成的，尤其瘢痕疙瘩是皮肤损伤愈合后所形成的过度生长的病理性瘢痕[34]。瘢痕会给患者带来疼痛、痉挛及功能障碍等，影响患者身心健康。ASCs可以有效降低成纤维细胞和肥大细胞的活性，从而调节胶原沉积，刺激血管再生，可在治疗瘢痕疙瘩中发挥作用[35]。

有研究表明，异常瘢痕形成与TGF-β1/Smad信号通路密切相关[36]。Penn等[37]将ASCs和成纤维细胞共培养，显示ASCs可以显著降低该通路中的转化生长因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、磷酸化Smad2/3以及Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白等关键成分，防止TGF-β1刺激成纤维细胞从而降低其增殖能力，可以有效抑制瘢痕形成。李响等[38]通过共培养ASCs与瘢痕疙瘩成纤维细胞，24 h后检测成纤维细胞相关指标，结果显示ASCs可以显著抑制成纤维细胞的增殖、迁移和胶原合成能力，并且作用效果可随ASCs的比例升高而增强。同时，ASCs还可以有效降低病理性瘢痕中成纤维细胞的侵袭性，抑制成纤维细胞向肌成纤维细胞转化，促进成纤维细胞凋亡。Li等[39]报道ASCs可通过P38/MAPK信号通路促进α-SMA阳性的成纤维细胞数量凋亡及磷酸化p38下调，从而降低胶原沉积，减小瘢痕形成。

3.3 ASCs参与构建组织工程化皮肤

ASCs具有多向分化潜能，例如直接分化为脂肪细胞而填充组织；分化为内皮细胞等促进新生血管形成，为移植组织提供营养，提高成活率；并且可旁分泌VEGF、HGF等多种细胞因子，促进周围组织修复再生[40]。而新兴支架材料等[41]辅助新技术的出现进一步提高了ASCs促进皮肤创面愈合的能力，而且也为其在皮肤组织工程的应用提供新的可能。支架材料可为ASCs的增殖和分化提供适宜的微环境，从而显著提高创面修复效果、减少瘢痕增生。Machula等[42]以电纺丝弹性蛋白原作为ASCs的递送载体以评价其在小鼠皮肤切口模型中的伤口愈合效果，显示ASCs处理组与对照组相比，伤口闭合速度和上皮厚度显著改善。Wang等[43]以基于多肽的FHE水凝胶（F127/OHA-EPL）作为支架材料结合ASCs外泌体修复大鼠皮肤损伤创面，与对照组相比，显著加快了创面愈合。Zonari等[44]在3-羟基丁酸-co-3-羟基戊酸共聚物（PHBV）结构上培养ASCs，并将其移植到小鼠背侧全层损伤模型中，与对照组相比，PHBV组的VEGF、bFGF和血管密度表达较高。这提示新生血管的形成，并可通过减少TGF-β1和α-SMA，上调TGF-β3的表达，从而修复皮肤缺损，减少伤口疤痕。

ASCs因可增殖分化为皮肤创面修复所需要的各种细胞，以及通过旁分泌作用分泌VEGF等各种生物活性物质的能力，从而调控参与皮肤修复的各种生理机能。因此，ASCs被认为是修复皮肤损伤及构建组织工程皮肤重要的细胞来源，不但在烧伤、慢性难愈性创面等诸多疾病的治疗领域取得了一定的成效，并且其作为种子细胞联合新型生物材料构建组织工程化皮肤，用于将来的大面积皮肤缺损修复也具有明显优势。但其向皮肤组织定向分化的诱导方案尚不完善，以及ASCs的混杂性等，都是ASCs应用于再生研究及临床转化的难题，有待进一步研究。