黄秀芳 原向伟 秦 英 陈忠羡

1.中山大学附属江门医院（江门市中心医院）病理科，广东江门 529030；2.中山大学附属江门医院（江门市中心医院）脊柱骨科，广东江门 529030

骨肉瘤是骨组织原发肿瘤中最常见的恶性肿瘤[1]，虽然发病率偏低，但其多发于青少年，恶性度极高，预后不佳[2]。顺铂常用于骨肉瘤患者的化疗，但因耐药和毒性作用等问题常影响其疗效[3-4]。干扰素α（IFN-α）已用于治疗多种肿瘤[5-6]，但其对骨肉瘤化疗敏感性的影响罕有报道。本研究探讨IFN-α 对人骨肉瘤U2OS细胞化疗敏感性的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞培养与试剂

U2OS 细胞来自中山大学病理学教研室，培养液为DMEM（GIBCO）[含10%胎牛血清（GIBCO）、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 链霉素]，5%CO2培养箱37℃培养。IFN-α 为Peprotech 产品；台盼蓝、顺铂购自Sigma；Z-VAD-FMK 为Calbiochem 产品；DNAzol 购自Invitrogen；Caspase-3（sc-7272）、Caspase-8（sc-56070）、Caspase-9（sc-56077）和GAPDH（sc-47724）等抗体购自Santa Cruz。

1.2 台盼蓝拒染法

细胞经0.4%台盼蓝染色，蓝染为死细胞，活细胞拒染，细胞生长抑制率=（对照组活细胞数－实验组活细胞数）/对照组活细胞数×100%。

1.3 Hoechst 33258 荧光染色

U2OS 细胞4℃固定10 min 后1000 r/min 离心5 min，加Hoechst 33258 避光染15 min，荧光显微镜下计数细胞，凋亡率=凋亡细胞数/视野全部细胞数×100%。

1.4 DNA Ladder

U2OS 细胞加DNAzol，4℃，12 000 r/min 离心15 min，取上清加无水乙醇4℃，10 000 r/min 离心10 min；加75%乙醇清洗，溶于TE，琼脂糖凝胶电泳成像。

1.5 Western blot

提取蛋白经SDS-PAGE 电泳后电转至PVDF 膜，TBST 4℃封闭过夜；一抗浓度均为1∶1000 稀释，室温封膜3 h，二抗4℃过夜，ECL 发光，Image J 计算灰度，实验重复3 次。

1.6 统计学方法

采用SPSS 15.0 统计分析数据，计量资料用均数±标准差（）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验；计数资料用百分率表示，组间比较采用χ2检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。……