陈旭 温贤铭 刘子由

【摘要】 目的：基于腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）/过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα）/信号转导子和转录激活因子3（STAT3）途径探讨姜黄素对血管壁巨噬细胞形成的影响。方法：本研究时间为2020年6-7月，将人单核细胞株THP-1细胞分为空白对照组、脂多糖（LPS）组、LPS+辛伐他汀组、LPS+姜黄素组，每组20个。将80只小鼠随机分为空白对照组、模型组、辛伐他汀组和姜黄素组，每组20只。比较各组人单核细胞株THP-1细胞迁移的数目、HMGB1和MCP-1蛋白表达水平、AMPK/PPARα/STAT3 mRNA相对表达量，比较各组小鼠血管壁巨噬细胞含量。结果：LPS组细胞的迁移能力、HMGB1和MCP-1蛋白表达水平均较空白对照组显著升高，LPS+辛伐他汀组和LPS+姜黄素组均较LPS组下降，且LPS+姜黄素组明显低于LPS+辛伐他汀组，差异均有统计学意义（P<0.05）。四组细胞迁移能力、HMGB1和MCP-1蛋白表达水平比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。LPS组细胞AMPK和PPARα mRNA、蛋白相对表达量均较空白对照组显著降低，而STAT3 mRNA、蛋白相对表达量升高，LPS+辛伐他汀组和LPS+姜黄素组细胞AMPK和PPARα mRNA、蛋白相对表达量均较LPS组升高，STAT3 mRNA、蛋白相对表达量均降低，且LPS+姜黄素组细胞AMPK和PPARα mRNA、蛋白相对表达量均较LPS+辛伐他汀组升高，STAT3 mRNA、蛋白相对表达量均降低，差异均有统计学意义（P<0.05）。体外实验中四组细胞AMPK/PPARα/STAT3 mRNA、蛋白相對表达量比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。模型组血管壁巨噬细胞含量明显高于空白对照组，辛伐他汀组和姜黄素组均明显低于模型组，姜黄素组显著低于辛伐他汀组，差异均有统计学意义（P<0.05）。四组血管壁巨噬细胞含量比较，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：姜黄素能够显著抑制LPS诱导的THP-1细胞迁移及血管壁巨噬细胞的形成过程，可能通过调节AMPK/PPARα/STAT3途径发挥作用，效果优于辛伐他汀。

【关键词】 腺苷酸活化蛋白激酶 过氧化物酶体增殖物激活受体α 信号转导子和转录激活因子3

姜黄素 巨噬细胞

Effect of Curcumin on Formation of Vascular Wall Macrophages by AMPK/PPARα/STAT3 Pathway/CHEN Xu， WEN Xianming， LIU Ziyou. //Medical Innovation of China， 2021， 18（24）： 0-028

[Abstract] Objective： To investigate the effect of Curcumin on the formation of vascular wall macrophages by adenylate activated protein kinase （AMPK）/peroxisome proliferator activated receptor α （PPARα）/signal transductor and transcriptional activator 3 （STAT3） pathways. Method： The research period was from June to July 2020， human mononuclear cell line THP-1 cells were divided into blank control group， lipopolysaccharide （LPS） group， LPS+Simvastatin group and LPS+Curcumin group， 20 cases in each group. Eighty mice were randomly divided into blank control group， model group， Simvastatin group and Curcumin group， 20 mice in each group. The number of human mononuclear cell line THP-1 cell migration， the protein expression levels of HMGB1 and MCP-1，

and the relative mRNA expression levels of AMPK/PPARα/STAT3 were compared among four groups， the content of macrophages in the blood vessel wall of four group were compared. Result： The migration ability， HMGB1 and MCP-1 protein expression levels of cells in LPS group were significantly increased compared with blank control group， while those in LPS+Simvastatin group and LPS+Curcumin group were decreased compared with LPS group， and LPS+Curcumin group was significantly lower than that in LPS+Simvastatin group， the differences were statistically significant （P<0.05）. Comparison of cell migration ability， HMGB1 and MCP-1 protein expression levels among four groups， the differences were statistically significant （P<0.05）. The mRNA and protein relative expression levels of AMPK and PPARα in LPS group were significantly decreased compared with blank control group， while the mRNA and protein relative expression levels of STAT3 were increased， the mRNA and protein relative expression levels of AMPK and PPARα in LPS+Simvastatin and LPS+Curcumin groups were increased compared with LPS group， the mRNA and protein relative expression levels of STAT3 were decreased， and the mRNA and protein relative expression levels of AMPK and PPARα in LPS+Curcumin group were increased compared with LPS+Simvastatin group， while the mRNA and protein relative expression levels of STAT3 were decreased， the differences were statistically significant （P<0.05）. Comparison of AMPK/PPARα/STAT3 mRNA and protein relative expression levels among four groups in vitro， the differences were statistically significant （P<0.05）. The content of macrophages in the vascular wall in model group was significantly higher than that in blank control group， and Simvastatin group and Curcumin group were significantly lower than that in model group， and Curcumin group was significantly lower than that in Simvastatin group， the differences were statistically significant （P<0.05）. Comparison of the content of macrophages in the blood vessel wall among four groups， the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion： Curcumin can significantly inhibit LPS induced THP-1 Cell Migration and the formation of vascular wall macrophages， possibly by regulating AMPK/PPARα/STAT3 pathway plays a role， and the effect is better than simvastatin.

[Key words] Adenylate activated protein kinase Peroxisome proliferator activated receptor α Signal transducer and activator of transcription 3 Curcumin Macrophage

First-author’s address： The First Affiliated Hospital of Gannan Medical College， Ganzhou 341000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.24.006

动脉粥样硬化是由内皮细胞损伤暴露、诱导循环血浆中单核细胞系变形，与暴露的内皮细胞中特定分子锚定并移入血管壁，促进巨噬细胞衍生泡沫细胞形成，即为粥样斑块的早期[1-3]。姜黄素是从中藥姜黄的根茎中提取得到的多酚类化合物，给予姜黄素能够显著降低ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化病变中巨噬细胞的数量，也能降低兔主动脉内皮细胞中粘附分子的表达，提示姜黄素能够从多个靶点干预动脉粥样硬化的形成和发展[4-6]。本实验进一步从腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）/过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα）/信号转导子和转录激活因子3（STAT3）信号通路探讨姜黄素对血管壁巨噬细胞形成的影响机制。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 本研究时间为2020年6-7月，人单核细胞株THP-1细胞，由上海生物科学研究所细胞资源中心提供;ApoE-/-小鼠80只，雌性小鼠40只，雄性小鼠40只，将其分为4组，每组10只雌性小鼠和10只雄性小鼠，平均重量（25.56±5.34） g，该小鼠由上海SLAC实验室提供，姜黄素（西安天丰生物科技有限公司），生产批号：118-39-5，纯度≥98%。

1.2 方法

1.2.1 实验步骤

1.2.1.1 体外细胞实验 将人单核细胞株THP-1细胞分为空白对照组（n=20个）、脂多糖（LPS）组（5 μg/mL，n=20个）、LPS+辛伐他汀组（LPS 5μg/mL+辛伐他汀5 μmol/L，n=20个）、LPS+姜黄素组（姜黄素80 μmol/L预处理THP-1细胞2 h，然后5 μg/mL LPS刺激THP-1细胞0.5 h，n=20个）。每组各需要20个人单核细胞株THP-1细胞，将20个单核细胞株THP-1细胞放入Transwell小室中，每个Transwell小室中放入一个单核细胞株THP-1细胞。采用Transwell迁移实验检测THP-1细胞的迁移能力，ELISA法检测细胞培养液腺苷酸活化蛋白激酶（HMGB1）和单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）的表达水平，RT-PCR和Western blot法分别检测AMPK、PPARα和STAT3 mRNA和蛋白的表达量。细胞培养：采用含10%胎牛血清+100 U/mL青霉素+100 U/mL链霉素的RPIM-1640培养基培养THP-1细胞，置于37 ℃，5% CO2培养箱中，隔天换液。细胞接种密度为2×105/mL，用肉豆蔻酸佛波酯刺激24 h。

1.2.1.2 体内动物实验 体内实验采用载脂蛋白E（ApoE）小鼠随机分为空白对照组（n=20）、模型组（n=20）、辛伐他汀组（0.2 mg/kg，n=20）和姜黄素组（80 mg/kg，n=20），除空白对照组外，其余各组皮下注射血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）1.44 mg/（kg·d），连续6周，空白对照组给予等量生理盐水皮下注射。实验结束后处死小鼠，制作主动脉切片。采用CD68免疫组织化学染色法计算小鼠血管壁巨噬细胞的含量。

1.2.2 检测方法

1.2.2.1 Transwell迁移试验 将巨噬细胞镀在24孔Transwell小室的下腔内，各处理组的THP-1细胞悬液加入上腔。在×1 000视野下观察迁移到下腔的THP-1细胞数目。

1.2.2.2 RT-PCR法 使用TRIzol试剂提取细胞总RNA，逆转录试剂盒进行互补DNA合成，设置反应体系和反应条件，图像分析仪扫描凝胶密度，分析得到mRNA的相对含量。

1.2.2.3 Western blot法 使用放射免疫沉淀试剂LS提取总蛋白质，用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离约30 μg蛋白裂解液，转移到聚偏二氟乙烯膜上，用抗PPARα、AMPK、STAT3抗体（1︰1 000稀释度）和GAPDH（1︰2 000稀释度），然后分别与次级抗体孵育。放射自显影技术进行增强化学发光培养。

1.2.2.4 CD68免疫组织化学染色法 10%水合氯醛麻醉小鼠，收集主动脉制作成5 μm厚切片，CD68免疫组织化学染色，显微镜下观察血管壁巨噬细胞数目。

1.3 观察指标 比较各组人单核细胞株THP-1细胞迁移的数目;比较各组体外细胞实验HMGB1和MCP-1蛋白表达水平;比较各组体外实验

AMPK/PPARα/STAT3 mRNA相对表达量;比较各组小鼠血管壁巨噬细胞含量。

1.4 统计学处理 采用SPSS 21.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，两两比较采用t检验，多组比较采用方差分析;计数资料以率（%）表示，比较采用字2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 体外实验中四组细胞迁移能力比较 空白对照组、LPS组、LPS+辛伐他汀组、LPS+姜黄素组细胞数目分别为（3.5±1.1）、（15.6±3.4）、（10.2±3.1）、（7.3±2.4）个。LPS组细胞的迁移能力较空白对照组显著升高，LPS+辛伐他汀组和LPS+姜黄素组较LPS组下降，且LPS+姜黄素组明显低于LPS+辛伐他汀组，差异均有统计学意义（P<0.05）。四组细胞迁移能力比较，差异有统计学意义（F=73.889，P=0.000）。

2.2 體外实验中四组细胞HMGB1和MCP-1蛋白表达水平比较 LPS组细胞HMGB1和MCP-1蛋白表达水平均较空白对照组显著升高，LPS+辛伐他汀组和LPS+姜黄素组均较LPS组下降，且LPS+姜黄素组明显低于LPS+辛伐他汀组，差异均有统计学意义（P<0.05）。体外实验中四组细胞HMGB1和MCP-1蛋白表达水平的比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.3 体外实验中四组细胞AMPK/PPARα/STAT3 mRNA相对表达量比较 LPS组细胞AMPK和PPARα mRNA相对表达量均较空白对照组显著降低，而STAT3 mRNA相对表达量升高，LPS+辛伐他汀组和LPS+姜黄素组细胞AMPK和PPARα mRNA相对表达量均较LPS组升高，STAT3 mRNA相对表达量均降低，且LPS+姜黄素组细胞AMPK和PPARα mRNA相对表达量均较LPS+辛伐他汀组升高，STAT3 mRNA相对表达量均降低，差异均有统计学意义（P<0.05）。体外实验中四组细胞AMPK/PPARα/STAT3 mRNA相对表达量的比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表2。

2.4 体外实验中四组细胞AMPK/PPARα/STAT3蛋白相对表达量的比较 LPS组细胞AMPK和PPARα蛋白相对表达量均较空白对照组显著降低，而STAT3蛋白相对表达量升高，LPS+辛伐他汀组和LPS+姜黄素组细胞AMPK和PPARα蛋白相对表达量均较LPS组升高，STAT3蛋白相对表达量均降低，且LPS+姜黄素组细胞AMPK和PPARα蛋白相对表达量均较LPS+辛伐他汀组升高，STAT3蛋白相对表达量降低，差异均有统计学意义（P<0.05）。体外实验中四组细胞AMPK/PPARα/STAT3蛋白相对表达量的比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表3。

2.5 体内动物实验中四组血管壁巨噬细胞含量的比较 体内动物实验显示，空白对照组、模型组、辛伐他汀组、姜黄素组的细胞数目分别为（3.4±1.1）、（15.6±3.4）、（10.2±3.2）、（7.6±2.5）个。模型组血管壁巨噬细胞含量明显高于空白对照组，辛伐他汀组和姜黄素组均明显低于模型组，姜黄素组显著低于辛伐他汀组，差异均有统计学意义（P<0.05）。四组血管壁巨噬细胞含量比较，差异有统计学意义（F=30.236，P=0.000）。

3 讨论

姜黄素通常被用于膳食香料和食品着色剂等方面[7-8]，当机体每日摄入姜黄素450～8 000 mg，持续1～4个月，可显著降低收缩压、血清甘油三酯和低密度脂蛋白水平，降低心血管病发生风险，明显改善内皮功能[9-11]。

本研究结果提示动脉硬化的单核细胞具有较强的迁移能力，是粥样硬化斑块形成的主要因素。辛伐他汀具有抑制单核细胞迁移的能力，并且姜黄素的抑制效应更强于辛伐他汀[12-14]。HMGB1和MCP-1蛋白均是单核细胞激活后释放的主要活性分子，表示单核细胞吞噬病原体和异物的能力，也是单核细胞向巨噬细胞和平滑肌下泡沫样细胞转化的主要活性因子[15-17]。AMPK/PPARα/STAT3途径参与了动脉粥样硬化的形成过程，同时姜黄素能够通过抑制AMPK/PPARα/STAT3途径进而影响动脉粥样硬化的形成[18-20]。体内实验发现，模型组血管壁巨噬细胞含量明显高于空白对照组，辛伐他汀组和姜黄素组明显低于模型组，且姜黄素组显著低于辛伐他汀组。姜黄素具有减少动脉粥样硬化不同动物模型中动脉瘤变的发展作用。

综上所述，姜黄素能够显著抑制LPS诱导的THP-1细胞迁移及血管壁巨噬细胞的形成过程，可能通过调节AMPK/PPARα/STAT3途径发挥作用，效果优于辛伐他汀。

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（收稿日期：2020-09-23） （本文编辑：姬思雨）