周晓红，卢晓丽，杨 雪，连 蕾，冯志星

(河北省邯郸市中心医院 腺体外科，河北 邯郸056001)

喉癌是一种临床上常见的头颈部癌症，其早期症状不明显或无特异性，多数患者被确诊时已处于中晚期阶段，且近年来随着环境污染及人们生活饮食的改变，其发病逐年上升[1]。目前，手术结合放化疗等综合治疗是喉癌主要的治疗方法，但中晚期患者病情严重，其疗效一般且预后往往较差，故如何提高患者的疗效具有重要的临床意义[2]。而熊果酸是是一种五环三萜类化合物，对多种肿瘤均有抑制作用，有助于促使癌细胞凋亡[3]。此外，相关研究显示，B淋巴细胞瘤-2(bcl-2)、凋亡相关因子Bcl-2相关X蛋白(Bax)是细胞凋亡重要的开关分子，其在癌细胞凋亡中具有重要的作用[4-5]。对此，本研究通过在喉鳞状细胞癌细胞中应用熊果酸进行实验，探讨其对喉鳞状细胞癌细胞bcl-2、Bax基因表达及凋亡的影响，以明确其对喉癌的抗肿瘤作用机制，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 主要材料Hep-2喉鳞状细胞癌细胞株(南京凯基生物有限公司)，新生胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，DMEM培养基(中国上海GIBICO公司)，二甲基亚砜(DMSO)、四甲基偶氮唑蓝(MTT)、熊果酸(美国Sigma公司)，注射用顺铂(山东齐鲁制药有限公司)，bcl-2、Bax基因引物(上海博亚生物公司)，caspase-3蛋白抗体(美国Proteintech公司)，反转录试剂盒、RNA提取分离试剂盒、逆转录-聚合酶链反应法(RT-PCR)荧光定量检测试剂盒均购自上海吉玛公司，PBS磷酸盐缓冲液(北京Solarbio公司)，显色试剂盒(美国Pierce公司)，其余材料均购自中国上海Hyclone公司；超净工作台、Facscalibur流式细胞仪及其配套试剂(美国BD公司)，核酸蛋白测定仪和化学发光凝胶成像仪(美国GE公司)，CO2培养箱(美国Thermo公司)，逆转录-聚合酶链反应法(RT-PCR)仪(美国Invitrogen公司)，680型酶标仪(美国Bio-Rad公司)，倒置显微镜和共聚焦荧光显微镜(日本Olympus公司)，其余仪器均购自苏州净化设备厂。

1.2 方法

1.2.1细胞选取 将复苏后的Hep-2喉鳞状细胞癌细胞株置入质量浓度为100 g/L胎牛血清的DMEM培养基中，在37℃、体积分数为5%的CO2、饱和湿度的培养箱中进行培养，选择生长状态良好和密度为85%以上时的细胞继续培养，加1 ml胰酶消化、取对数生长期细胞用于实验。

1.2.2分组及培养 取Hep-2喉鳞状细胞癌细胞依据随机数字表分为A组、B组、C组，每组10个复孔，A组给予常规培养，B组在此基础给予50.0 μmol/L熊果酸培养，C组给予6 μmol/L顺铂培养；调整细胞浓度至5×104个细胞/ml，并制成细胞悬液接种于96孔板，每孔滴加20 μl的MTT，培养4h后去上清，每孔加入200 μl的DMSO并振荡10 min，待检测。

1.2.3RT-PCR检测 于处理1 h和处理1、3、5 d取Hep-2喉鳞状细胞癌细胞、加0.25%胰酶消化并离心(1 000 r/min、5 min)后，收集细胞、提取总RNA并反转录合成cDNA，设计bcl-2、Bax基因引物序列(见表1)，将1 μl的cDNA置于10 μl反应体系中94℃扩增2 min、胶回收法纯化DNA片段后进行RT-PCR反应，以β-actin为内参，以2-△△CT法计算bcl-2、Bax基因相对表达量，并计算其比值bcl-2/Bax[4-5]。

1.2.4Western Blot(WB)检测 于处理1 h和处理1、3、5 d取Hep-2喉鳞状细胞癌细胞提取细胞总蛋白、变性、凝胶电泳、转膜、封闭2 h后，设β-actin对照组，加1∶1000的caspase-3蛋白一抗，4℃杂交12 h、加二抗、洗膜、显影后，酶标仪扫描分析吸光度后分析灰度值，并计算相对表达量=(caspase-3蛋白灰度值/β-actin灰度值)×100%。

1.2.5细胞增殖实验(MTT法)检测 于处理1 h和处理1、3、5 d在96孔板中，每孔加入10 μl的MTT(5 g/L)孵育4 h、加150 μl的DMSO、震荡10 min，通过酶标仪检测570 nm波长吸光度(OD值)，测量3次并取平均值。

表1 bcl-2、Bax基因引物序列

2 结果

2.1 两组bcl-2、Bax基因表达量及bcl-2/Bax比较

A组、B组和C组处理1h bcl-2、Bax基因表达量及bcl-2/Bax比较，差异无统计学意义(P>0.05)，B组和C组处理1、3、5 d的bcl-2基因表达量明显低于A组，B组和C组处理1、3、5 d的Bax基因表达量、bcl-2/Bax明显高于A组，差异有统计学意义(P<0.05)，B组和C组处理1、3、5 d的bcl-2基因表达量、Bax基因表达量、bcl-2/Bax比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表2、3、4和图1、2。

表2 两组bcl-2基因表达量比较(%)

表3 两组Bax基因表达量比较(%)

表4 两组bcl-2/Bax比较

图1 两组bcl-2基因表达量的RT-PCR检测

图2 两组Bax基因表达量的RT-PCR检测

2.2 两组caspase-3蛋白表达量比较

A组、B组和C组处理1h caspase-3蛋白表达量比较，差异无统计学意义(P>0.05)，B组和C组处理1、3、5 d的caspase-3蛋白表达量明显高于A组，差异有统计学意义(P<0.05)，B组和C组处理1、3、5 d的caspase-3蛋白表达量比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表5和图3。

2.3 两组喉癌Hep-2细胞A570值比较

A组、B组和C组处理1 h比较，差异无统计学意义(P>0.05)，B组和C组处理1、3、5d的喉癌Hep-2细胞A570值明显低于A组，差异有统计学意义(P<0.05)，B组和C组处理1、3、5 d的喉癌Hep-2细胞A570值比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表6。

3 讨论

喉癌是头颈部常见的恶性肿瘤之一，其发病机制尚未明确，主要与环境、饮食及生活习惯、遗传等有关，可导致痰中带血、吞咽困难、声嘶等症状，若未及时治疗，其临床预后差、死亡率高[1-2]。而喉癌主要采取以手术为主、以放疗等其他治疗为辅的综合治疗，可改善患者的病情，但仍有部分患者因局部复发或转移而导致疗效欠佳，严重影响患者的生存预后[5-6]。

表5 两组caspase-3蛋白表达量比较(%)

图3 两组caspase-3蛋白表达量的WB检测

表6 两组喉癌Hep-2细胞A570值比较(%)

熊果酸是一种具有多种生物学活性的五环三萜类化合物，且随着研究的深入，其具有良好的抗氧化、抗炎、降血脂、抗增殖、抗癌、抗诱变等作用，尤其是对肿瘤细胞增殖具有良好抑制的作用[7-8]。有研究显示，对舌鳞癌细胞Tca-8113给予熊果酸处理，其可通过调节多种细胞凋亡相关蛋白的表达，从而有效抑制舌鳞癌细胞增殖并促进其凋亡[9]。而相关研究表明，细胞凋亡是一种继发性程序化死亡过程，有多种基因参与调控，其中bcl-2、Bax是启动凋亡的重要开关基因，bcl-2具有抑制线粒体破裂、多种凋亡蛋白激活及调节细胞内钙浓度等作用，并可抑制促凋亡蛋白Bax细胞毒性而抑制细胞凋亡[10-11]；Bax是受bcl-2调节的促凋亡蛋白，具有诱导线粒体渗透性改变、激活凋亡蛋白、释放细胞色素等，在细胞凋亡中具有重要的作用[12-13]。此外，caspase-3是细胞凋亡中主要的效应蛋白，具有破坏细胞外基质蛋白和骨架蛋白、裂解DNA修复相关分子、抑制凋亡蛋白活性等作用，其活化可启动细胞凋亡进程并进入不可逆阶段[14-15]。

本研究结果显示，B组和C组处理1、3、5 d的bcl-2基因表达量明显低于A组，B组和C组处理1、3、5 d的Bax基因表达量、bcl-2/Bax、caspase-3蛋白表达量明显高于A组，B组和C组处理1、3、5 d的bcl-2基因表达量、Bax基因表达量、bcl-2/Bax、caspase-3蛋白表达量比较无统计学差异，表明熊果酸能够有效下调喉癌Hep-2细胞的bcl-2基因表达及上调其Bax基因、caspase-3蛋白表达。这可能是由于熊果酸对肿瘤细胞增殖具有良好抑制的作用，能够有效调节多种细胞凋亡相关蛋白的表达，尤其是其可能通过下调bcl-2基因表达及上调Bax基因、caspase-3蛋白表达等细胞凋亡相关基因表达，使bcl-2基因对喉癌Hep-2细胞抑制线粒体破裂、多种凋亡蛋白激活及调节细胞内钙浓度等作用下降，有助于降低bcl-2基因对喉癌Hep-2细胞凋亡的作用；同时，上调Bax基因表达能够增强其诱导线粒体渗透性改变、激活凋亡蛋白、释放细胞色素等作用，上调caspase-3蛋白能够破坏喉癌Hep-2细胞外基质蛋白、骨架蛋白及裂解其DNA修复相关分子，有助于促使喉癌Hep-2细胞的凋亡。此外，本研究中，B组和C组处理1、3、5 d的喉癌Hep-2细胞A570值明显低于A组，此结果与Niu JT、马海滨等[13-14]研究相似，B组和C组处理1、3、5 d的喉癌Hep-2细胞A570值比较无统计学差异，表明熊果酸能够有效抑制喉癌Hep-2细胞增殖而促使其凋亡。这可能是由于熊果酸能够有效促使多种细胞凋亡相关蛋白表达而抑制喉癌Hep-2细胞的增殖能力，尤其是能够有效调节细胞凋亡相关基因中bcl-2、Bax基因的表达平衡状态，使喉癌Hep-2细胞的凋亡信号增强而促使caspase-3等细胞凋亡相关蛋白表达增加，从而启动喉癌Hep-2细胞的凋亡进程并进入不可逆阶段而促使喉癌Hep-2细胞的凋亡。本研究也有不足之处，如熊果酸如何下调bcl-2基因表达及上调Bax基因、caspase-3蛋白表达仍不清楚，提示仍需大量的研究。

综上所述，熊果酸可有效抑制喉癌Hep-2细胞的增殖能力而促使其凋亡，其机制可能与下调bcl-2基因表达及上调Bax基因、caspase-3蛋白表达有关，提示其可望成为喉癌临床治疗的新药物。