章碧静 吕伟旗 陈健苗

络石藤系夹竹桃科藤本植物络石Trachelospermum jasminoides（Lindl.）Lem.的干燥带叶藤茎，性苦，微寒，归心、肝、肾经，具有祛风通络，凉血消肿的功效，临床多用于治疗风湿热痹，筋脉拘挛，腰膝酸痛，喉痹，痈肿，跌扑损伤等症[1-2]。研究表明，络石藤干燥藤茎中富含木脂素、黄酮、萜类、甾醇、生物碱等多种化学成分[2-4]，具有抗炎镇痛、抗氧化、降血脂等药理活性[5-6]。络石藤在我国安徽、浙江、陕西、江西、云南、广西等省均有分布，南北跨度较大，而现有报道多集中在化学成分[7]、药理作用[8]、伪品鉴别[9]、临床应用[10]等方面，针对不同产地络石藤木脂素含量测定的研究鲜有报道，已有的含量测定也仅集中在少数产地[11]。木脂素类（络石苷、去甲络石苷）是络石藤的主要有效成分，具有抗炎、镇痛、抑菌等药理活性，络石苷是2020 年版《中华人民共和国药典》规定的质量评价标准之一[1]。本研究收集安徽、浙江、陕西、江西、云南等络石藤主分布区种质资源19 份，建立高效液相色谱法（HPLC）对其干燥藤茎中络石苷与去甲络石苷进行含量测定，分析其与原植物生长性状、产地生境因子（经纬度、海拔）间的相关性，以期为络石藤药材质量控制提供试验依据。

1 材 料

1.1 络石藤种质资源 2019 年11 月—2019 年12月，采集浙江、安徽、陕西、江西、云南、广西、湖南、河南等省络石藤种质资源19 份，经浙江省丽水市人民医院药学部陈健苗主任药师鉴定为夹竹桃科络石T.jasminoides 的干燥带叶藤茎，见表1。

1.2 仪器与试剂 2695 型高效液相色谱仪（美国Waters 公司）；FRQ-1008HT 小型超声波清洗机（杭州法兰特超声波科技有限公司）；ESJ120-4A 型电子分析天平（沈阳龙腾电子有限公司）；DHG-9053A 型台式鼓风干燥箱（无锡玛瑞特科技有限公司）；小型多功能粉碎机（拜杰仪器有限公司）；SHB-IIIG 型台式循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；络石苷（B20810，上海源叶生物科技有限公司）；去甲络石苷（PR3275，信阳市中检计量生物科技有限公司）；色谱乙腈、色谱甲醇（上海耀勘化工有限公司）；其他甲醇等试剂为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。

表1 络石藤样品信息

2 方 法

2.1 生长性状测定 取络石藤新鲜藤茎，用卷尺测量藤茎长，用游标卡尺测量藤茎粗、叶片中脉长（叶长）与叶宽，计算叶长宽比=叶长/叶宽，n=15。

2.2 木脂素含量测定

2.2.1 色谱条件 Agilent Extend-C18 色谱柱（4.6×250mm，5μm），流动相乙腈-0.2%冰醋酸溶液，体积流速1.0mL/min，检测波长λ=280nm，柱温28℃，进样量10μL，HPLC 色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图

2.2.2 线性关系考察 配制浓度分别为0.612、1.224、1.836、2.448、3.060、6.120mg/L 的络石苷标准品溶液，及浓度为0.128、0.256、0.384、0.512、0.640、1.280mg/L的去甲络石苷标准品溶液，过0.45μm 微孔滤膜，在“2.2.1”色谱条件下进样，以峰面积Y 为纵坐标，标准品浓度X 为横坐标，得络石苷线性方程为Y1=3537.1X1－67273，R2=0.9995，在61.2～612μg/mL 范围内线性关系良好，得去甲络石苷线性方程为Y2=4218.8X1－16603，R2=0.9996，在12.8～128μg/mL 范围内线性关系良好。

2.2.3 样品溶液制备 将络石藤切片，60℃烘箱烘至恒重，粉碎过60 目筛，置于干燥器中保存待用。精密称取粉末2g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇80mL，称重，浸泡过夜，室温超声处理（功率250W，频率35kHz）30min，冷却至室温，甲醇补足失重，抽滤，滤液定容至100mL 容量瓶。吸取样品溶液适量，过0.45μm 微孔滤膜，在“2.2.1”色谱条件下进样，测定峰面积（n=3）。

2.2.4 精密度试验 取络石苷与去甲络石苷对照品，过0.45μm 微孔滤膜，在“2.2.1”色谱条件下进样6 次，测定络石苷与去甲络石苷峰面积RSD 分别为0.22%与0.18%，表明仪器精密度良好。

2.2.5 稳定性试验 取浙江仙居样品，在“2.2.3”条件下制备样品溶液，在“2.2.1”色谱条件下分别于2、4、8、12、16、20、24h 进样，测得络石苷与去甲络石苷峰面积RSD 分别为1.06%与1.78%，表明样品溶液在24h 稳定性良好。

2.2.6 重复性试验 取浙江仙居样品，连续称样6次，在“2.2.3”条件下制备样品溶液，在“2.2.1”色谱条件下进样，测得该样品络石苷与去甲络石苷平均含量分别为2.43mg/g 与8.39mg/g，RSD 为2.01%与1.66%，表明方法重复性良好。

2.2.7 加样回收率试验 精密称取络石苷与去甲络石苷含量已知的浙江仙居样品适量，加入适量标准品，在“2.2.3”条件下制备样品溶液，在“2.2.1”色谱条件下进样，测定峰面积，计算加样回收率，试验平行6次，见表2。

表2 加样回收率试验（n=6）

2.3 统计学方法 不同产地间络石藤生长性状、木脂素类成分含量比较应用SPSS 23.0 统计软件单因素ANOVA 方差分析，木脂素类成分含量与生境因子间相关性分析应用Excel 2010 数据分析中相关系数工具包，络石藤聚类分析应用SPSS 23.0 统计软件组间联接法[12]，P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 生长性状比较 19 个产地络石藤生长性状存在差异（P＜0.05 或P＜0.01），藤茎长与藤茎粗的变幅分别为3.45～9.32m 与1.78～4.56mm，其中云南大姚络石藤藤茎长、藤茎粗、叶长指标数值最大，分别为9.32m、4.56mm 与8.26cm，云南巧家络石藤叶片最宽，叶宽数值为3.21cm，广西西林络石藤叶片最为狭长，叶长宽比数值为2.76，而陕西汉阴络石藤叶片最为宽钝，叶长宽比数值最小，仅为1.47，见表3。

3.2 木脂素类成分含量比较 19 个产地络石藤中去甲络石苷与络石苷含量存在差异（P＜0.01），平均含量分别为2.05mg/g 与6.84mg/g，变幅为1.19～2.89mg/g 与4.75～10.02mg/g。从络石苷含量看，供试19 个产地络石藤中络石苷含量均满足2020 年版《中华人民共和国药典》[1]规定不低于4.5mg/g 的标准，表明供试络石藤药材质量良好。19 个产地中，浙江与河南样品中去甲络石苷与络石苷含量较高，湖南样品次之，安徽、陕西、江西、云南与广西样品含量较低，其中浙江缙云样品去甲络石苷含量最高，为2.89mg/g，是其他样品的1.05～2.43 倍，浙江磐安样品络石苷含量最高，为10.02mg/g，是其他样品的1.07～2.11 倍，见表3。

3.3 相关性分析 供试络石藤中络石苷、去甲络石苷与生长性状、生境因子关系密切（见表4）。络石苷与藤茎长、藤茎粗、叶长、叶长宽比、经度、纬度呈正相关关系，其中与经度正相关性最高，相关系数为0.6835，与叶长宽比正相关性次之，相关系数为0.3317，与海拔呈唯一负相关关系，相关系数为-0.4216，而与叶宽相关性较低，相关系数仅为0.0167；去甲络石苷与叶长宽比、经度、纬度呈正相关关系，其中与经度正相关性最高，相关系数为0.5224，与叶长宽比正相关性次高，相关系数为0.1801，与叶宽、海拔呈负相关关系，其中与海拔负相关关系最高，相关系数为-0.2914，而与叶长相关性较低，相关系数仅为0.0503。相关性分析结果表明，在供试经纬度与海拔范围内，高经纬度、低海拔地区种植络石藤有利于其藤茎中络石苷与去甲络石苷成分含量积累。

3.4 聚类分析 以木脂素含量与生长性状为参考指标，根据欧式距离D2=18.05 将19 个产地划分为4 个类群（见图2）。第Ⅰ类群共4 个产地，为云南与广西产地，包括云南大姚、云南巧家、广西西林与广西乐业，该类群络石藤植株较高，藤茎较粗壮，叶片大而狭长，但络石苷与去甲络石苷含量较低；第Ⅱ类群共8 个产地，为浙江、湖南与河南产地，该类群络石藤植株中等高度，叶片较大或中等大小，叶型多狭长少宽厚，络石苷与去甲络石苷含量较高；第Ⅲ类群仅2 个产地，为安徽休宁与安徽祁门，该类群络石藤植株较矮，藤茎较细，叶片小而多宽厚，络石苷与去甲络石苷含量较低；第Ⅳ类群共5 个产地，包括陕西蓝田、陕西汉阴、江西永新、陕西柞水与江西婺源，该类群络石藤植株最矮，藤茎细，叶片小而宽厚，络石苷与去甲络石苷含量较低。

表3 络石藤生长性状、木脂素类成分含量比较

表4 络石藤中2 种木脂素含量与生长性状、生境因子间的相关性

图2 19 批络石藤样品聚类分析图

4 讨论

络石苷是2020 年版《中华人民共和国药典》规定的络石藤药材及其饮片的主要质量评价指标，具有抗炎、镇痛、抑菌等药理活性，在已有文献与2020年版《中华人民共和国药典》的基础上[1，11]，本试验考察了提取溶剂（甲醇、80%甲醇、乙醇）、提取方式（超声、加热回流、索式提取）、提取时间（20min、30min、40min）、流动相（甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.2%冰醋酸）及检测波长对络石藤中络石苷与去甲络石苷含量测定的影响，发现以甲醇为提取溶剂，在室温超声（功率250W，频率35kHz）提取30min 即可提取完全，在Agilent Extend-C18 色谱柱（4.6×250mm，5μm），流动相乙腈-0.2%冰醋酸，流速1.0mL/min，检测波长280nm，柱温28℃，进样量10μL 的色谱条件下，洗脱效果较好，去甲络石苷与络石苷的保留时间分别为22.51min 与28.36min，色谱峰分离度均＞1.5，理论塔板数＞4500，定量限分别为2.86μg/mL 与5.28μg/mL，检测限为2.13μg/mL 与3.95μg/mL。本试验建立HPLC 测定络石藤干燥带叶藤茎中去甲络石苷与络石苷含量操作简单，重复性好，准确度高，可用于络石藤药材质量评价与质量控制。

19 个产地络石藤中去甲络石苷、络石苷含量存在差异（P＜0.01），其中浙江与河南样品含量较高，湖南样品次之，安徽、陕西、江西、云南与广西样品含量较低；经度、纬度、海拔与络石藤中去甲络石苷、络石苷含量积累关系密切，在供试经纬度与海拔范围内，高经纬度、低海拔地区种植络石藤有利于其藤茎中络石苷与去甲络石苷成分含量积累；从络石苷与去甲络石苷含量看，络石藤优良种质选育可优先在高经纬度、低海拔的浙江与河南产地中选择，而从藤茎产量指标看，可优先在云南与广西产地中选择。中药材中有效成分含量受诸多环境因素影响，这些环境因素之间往往具有自相关性[13]。本实验将进一步在络石藤优良种质筛选的基础上，开展不同种质在同一区域（不同海拔）条件下种植实验，以期筛选出高木脂素含量、高产量的络石藤优良种质。同时，因络石藤在我国分布较广，课题组将进一步收集其他分布区如广东、江苏、贵州等种质资源，扩充络石藤种质资源库，为络石藤优良品种选育提供种质资源。