吴 凡，李惠杰，杨光宇，郭亚东，胡秋芬，梁梦洁

(1.云南民族大学民族医药学院，昆明 650504；2.云南中烟工业有限责任公司技术中心，昆明 650106；3.昆明医科大学药学院，昆明 650504；4.云南云天化股份有限公司研发中心，昆明 650228)

众所周知，吸烟可导致肺癌、呼吸系统疾病和心脑血管疾病等多种疾病，这是由于香烟烟雾是一种丰富的自由基来源，它通过活性氧(ROS)的直接传递和炎症细胞的激活促进ROS的内源性生成，产生氧化应激损伤。8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)和8-羟基鸟苷(8-OHG)分别对应脱氧核糖核酸和核糖核酸的氧化损伤[1]，而且这两种化合物在体内化学稳定性好，其含量的测定可为有效评价机体的氧化损伤提供帮助，在疾病病理研究过程中常作为氧化应激的生物标记物[2-3]。

尿液可通过无创取样，因此样品易得。尿液中8-OHdG 和8-OHG 的测定可为有效，评价机体各种因素引起的氧化损伤提供关键数据，尿液中8-OHd G 和8-OHG 的测定在国内外引起了广泛的关注[4-5]。目前测定8-OHd G 和8-OHG 的方法有酶联免疫法、气相色谱-质谱法、电化学方法、高效液相色谱-串联质谱法等[6-8]。其中，高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)选择性好、灵敏度高，在8-OHd G 和8-OHG 测定中得到了广泛应用[9-14]。但尿液样品基质复杂，样品前处理需用固相萃取、液液萃取、柱层析等方法进行净化，而且尿液样品取样后需超低温冷冻保存，试验前需解冻后才能进行前处理。尿液样品的前处理不但操作繁琐，而且引入误差的因素较多。因此，寻找高效、简便的8-OHdG和8-OHG 测定方法十分必要。

本工作自主设计了样品离心分离和过滤装置对尿液样品进行前处理，并结合高效液相色谱-串联质谱法分别测定不同吸烟者尿液样品中的8-OHd G和8-OHG，两种化合物在4.5 min内可达到完全分离。方法用于实际尿液样品中8-OHdG 和8-OHG的测定，取得满意结果。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

液相色谱-质谱联用仪，包括Waters Acquity型超高效液相系统、API-5500型三重四极杆质谱检测器和Analyst色谱工作站。

8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷的标准储备溶液:1.00 g·L－1，分别称取8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷的标准品100 mg于100 mL容量瓶中，用甲醇定容，于4 ℃冰箱保存，有效期为3个月。

内标储备溶液:10 mg·L－1，称取15N5-8-羟基脱氧鸟苷(15N5-8-OHd G)标准品1 mg于100 mL容量瓶中，用甲醇定容。

内标溶液:5μg·L－1，移取50μL 的10 mg·L－1内标储备溶液至100 mL容量瓶中，用适量水溶解并定容。

8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷标准品的纯度均不小于98%；15N5-8-OHd G 标准品的纯度不小于98%；其余试剂均为色谱纯；试验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

1)色谱条件 Synergi Polar-RP 色谱柱(50 mm×2.0 mm，2.5μm)，Synergi Polar-RP保护柱(5 mm×2.0 mm，2.5μm)，柱温30 ℃；流量10μL·min－1；进样体积5.0μL；进样针距瓶底2.0 mm。流动相:A 为10 g·L－1乙酸铵溶液，B 为甲醇。梯度洗脱程序:0～1.0 min 时，A 为80%；1.0～2.0 min时，A 由80%降至60%；2.0～4.5 min时，A 由60%降至10%；4.5～5.0 min时，A 由10%升至80%，保持3.0 min。

2)质谱条件 电喷雾离子源(ESI)，正离子模式；多反应监测模式；雾化气压力410 kPa，气帘气压力240 kPa，辅助加热气压力275 kPa；碰撞电压20 V，去簇电压45 V，电喷雾电压5 500 V；驻留时间150 ms。其余质谱参数见表1。

表1 质谱参数Tab.1 MS parameters

1.3 试验方法

1.3.1 样品离心分离和过滤装置

自主设计的样品离心分离和过滤装置见图1。

图1 样品离心分离和过滤装置Fig.1 Device for centrifugation and filtration of the sample

由图1可知:该装置由离心管(a)和带0.45μm过滤筛板和密封圈的内套管(b)组成。尿液样品离心完成后，在离心管中插入带过滤筛板的内套管，并向下压(c)，样品溶液即可从内套管的细管中流出，用色谱进样瓶收集流出的过滤液用于分析。

1.3.2 8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷的测定

将招募的志愿者分为3组:非吸烟者、轻度吸烟者(每天5～15支)、中度吸烟者(每天15～25支)、重度吸烟者(每天25～50支)。分别收集每位志愿者的尿液于容器中，待处理。

移取2.5 mL采集的尿液样品于10 mL离心管中，加入250μL 的5μg·L－1内标溶液，然后用甲醇定容到5.0 mL(控制样品介质中甲醇的体积分数约为50%)。样品充分摇匀后于－4 ℃保存。分析时，将离心管以12 000 r·min－1转速离心10 min，取下离心管，在离心管中插入带有过滤筛板和密封圈的内套管，并向下按压，用色谱进样瓶收集流出的过滤液，按仪器工作条件进行测定。

2 结果与讨论

2.1 色谱行为

按仪器工作条件对8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷的混合标准溶液(含5μg·L－1的内标)进行测定，其多反应监测色谱图见图2。

由图2可知:8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷在4.5 min内可达到完全分离。梯度洗脱运行完成回到起始点仅需3.0 min就可达到平衡，可继续进行下一个样品分析。和常规液相色谱法相比，本方法有效缩短了分析时间。

2.2 样品稳定剂的选择

图2 8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷混合标准溶液的多反应监测色谱图Fig.2 MRM chromatograms of mixed standard solution of 8-OHdG and 8-OHG

新鲜尿液样品稳定性差，在室温下样品中的目标物会在活性酶的作用下继续代谢而发生变化，也有可能会在微生物的作用下发生变质。在传统方法中，样品需用超低温冰箱冷冻保存，样品分析时，需解冻并平衡到室温才能进行样品前处理，操作繁琐且处理周期长。为了简化样品前处理流程，试验采用在尿液样品中加入甲醇稳定样品后直接于－4 ℃保存的方法。一方面，甲醇的加入可让样品中的活性酶失活，阻止目标物继续代谢分解；另一方面，甲醇的加入还能抑制样品中微生物的繁殖，限制了因微生物繁殖而引起的样品变质和目标物变化。

试验发现:采集尿液样品后立即进行分析，测得8-羟基脱氧鸟苷、8-羟基鸟苷的质量浓度依次为4.28，8.22μg·L－1。在采集的尿液样品中加入甲醇(控制样品介质中甲醇的体积分数约为50%)于－4 ℃放置一周后再进行分析，测得8-羟基脱氧鸟苷、8-羟基鸟苷的质量浓度依次为4.15，8.01μg·L－1。8-羟基脱氧鸟苷、8-羟基鸟苷在1周内的降解率不超过5%，即当样品介质中甲醇的体积分数约为50%时，尿液样品中的8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷可保持稳定。试验选择样品稳定剂为甲醇，控制样品介质中甲醇的体积分数约为50%。

2.3 样品净化方法的选择

高效液相色谱-串联质谱法的测定灵敏度能达到尿液样品中8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷直接测定的要求，但在传统方法中，一般还需通过固相萃取净化样品，以消除基质效应对样品测定的干扰。为了简化样品净化步骤，试验采用在实际尿液样品中加入8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷的混合标准溶液绘制标准曲线，让标准曲线的基质和样品基质基本保持一致，扣除了基质效应干扰，这样样品可不经固相萃取净化直接进样分析。

尿液样品需经离心分离、滤膜过滤后才可进样分析。为了更简便地实现样品过滤，试验自主设计了样品离心分离和过滤的装置(图1)。此装置可不经过样品转移就能实现样品过滤。和常规方法中把离心后的样品转移出来再用针头过滤器过滤相比，此装置简化了净化步骤。

2.4 色谱柱的选择

由于8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷的反相保留效果较差，因此需要通过提高流动相中水相比例或增加色谱柱长度来增强保留作用，但持续的高比例水相会影响常规C18色谱柱的使用寿命。Synergi Polar-RP液相色谱柱(50 mm×2.0 mm，2.5μm)为极性端基封尾的醚连接苯基相色谱柱，特别适合大极性及芳香族化合物的分离，可用于分离8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷。为了获得更好的色谱分离效果，试验选用Synergi Polar-RP 液相色谱柱(50 mm×2.0 mm，2.5μm)。

2.5 质谱条件的选择

为了获取较好的稳定性和灵敏度，将5.0μg·L－1的8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷的混合标准溶液(含5μg·L－1的内标)注入ESI中，在正离子模式下对8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷及内标进行一级质谱扫描，得到它们的准分子离子[M＋H]＋，然后对准分子离子进行子离子扫描，得到离子碎片信息，定性离子对和定量离子对见表1。试验进一步对碰撞能量、去簇能量等参数进行了优化，试验选择的质谱条件见1.2节。

2.6 标准曲线、检出限和测定下限

用含50%(体积分数)甲醇的空白尿液样品(含5μg·L－1的内标)稀释混合1.00 g·L－1的8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷的标准储备溶液得到0.5，1.0，2.5，5.0，10，20，40μg·L－1的基质混合标准溶液系列，按试验方法对其进行测定，并绘制标准曲线。8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷的线性范围均为0.2～40μg·L－1，线性回归方程和相关系数见表2。

根据3倍信噪比计算方法的检出限(3S/N)，根据10倍信噪比计算方法的测定下限(10S/N)，结果见表2。

表2 线性回归方程、相关系数、检出限和测定下限Tab.2 Linear regression equations，correlation coefficients，detection limits and lower limits of determination

2.7 精密度和回收试验

随机选取一份中度吸烟者的尿液样品，按试验方法进行分析，并进行加标回收试验，平行测定7次，连续测定7 d，计算日内、日间的回收率及测定值的日内相对标准偏差(RSD)、日间RSD，结果见表3。

表3 精密度和回收试验结果(n＝7)Tab.3 Results of tests for precision and recovery(n＝7)

由表3可知:日内回收率、日间回收率分别为92.3%～96.3%，93.4%～96.3%，日内RSD 和日间RSD 分别为1.6%～3.0%，2.8%～3.4%。这说明方法具有较好的回收率和精密度。

2.8 样品分析

按试验方法分析12名志愿者(包括非吸烟者、轻度吸烟者、中度吸烟者、重度吸烟者)的尿液样品，样品分析结果见表4。

表4 样品分析结果Tab.4 Analytical results of the samples μg·L－1

由表4可知:非吸烟者尿液中8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷含量较吸烟者尿液中8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷含量低；不同吸烟者尿液中的8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷含量和吸烟量有一定相关性。

采用Spearman Rank Correlation 方法[15]，对吸烟者的不同吸烟水平与尿液中8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷含量间的相关性进行分析。结果表明:吸烟者尿液中8-羟基脱氧鸟苷含量和8-羟基鸟苷含量均与吸烟水平呈正相关(相关系数均为0.972 0，概率均小于0.000 1)。吸烟者吸烟程度越大，其尿液中的8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷含量越高。因此，吸烟者尿液中8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷含量均与吸烟水平相关。通过8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷的测定可初步判断人体卷烟烟气暴露水平。

本工作采用高效液相色谱-串联质谱法快速测定吸烟者尿液中8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷的含量。方法操作简单，简化了前处理步骤，同时能够获得较好的回收率和精密度，可用于大批量尿液样品的分析，为评估吸烟行为对氧化应激损伤的影响提供了科学的依据。