武国凡 成宏斌 吴玉俊 沈 娟 吴旺泽*

（1. 西北师范大学生命科学学院，兰州 730070；2. 兰州大学生命科学学院，兰州 730030）

CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）基因簇是细菌和古生菌基因组中广泛存在的一种DNA重复序列家族。在该重复序列上游还存在一个多态性的Cas（CRISPR associated）蛋白家族基因，它们伴随着细菌和古生菌的进化，形成了一种高度保守的CRISPR/Cas 系统。研究显示，这种特殊的CRISPR/Cas 系统构成了原核生物的获得性免疫防御系统，以抵抗外源遗传物质的入侵［1］。所以研究者利用细菌这种特殊的CRISPR/Cas 系统，开发了继锌指核酸内切酶（Zinc finger endonuclease，ZFN）和类转录激活因子效应物核酸酶（Transcription activator-like effector nuclease，TALEN）技术之后发展起来的另一种基因组编辑新技术，由于它灵活、高效且易于操作，该技术已成为目前最为热门的基因组编辑工具［2］。

根据Cas结构和功能的不同，CRISPR/Cas系统可大体分为两类，第一类编辑系统对外源基因组的剪切需要一个较大的Cas蛋白复合物和引导RNA；第二类编辑系统对外源基因组的剪切只需要一个单一的剪切蛋白，如Cas9蛋白和cpf1蛋白。因此通过CRISPR/Cas9系统，研究者仅需基于靶基因的基因序列，合成一个含PAM（Protospacer Adjacent Motifs）序列的sgRNA 靶序列，即可通过Cas9 蛋白的核酸内切酶活性可以通过切割靶DNA并形成体内DNA 修复机制并使DNA 双链断裂（DSB）导致基因修饰，造成基因突变（如：插入，缺失和置换）［3～4］。目前CRISPR/Cas9基因编辑技术不仅在动物遗传突变体的构建，以及遗传性疾病治疗等方面发挥重要作用，而且在作物新品种选育和作物改良中也具有重要意义［5～7］。因此，这一技术的广泛应用，极大加快了人类对功能基因的深入研究。……