李晓良,王 雪,邱晓鹏,路思佳,辛凤丹,郑 兴 (.西安理工大学,西北旱区生态水利国家重点实验室,陕西 西安 70048；.西安交通大学环境科学与工程系,陕西 西安 70049)

我国作为抗生素生产与消费大国,抗生素的滥用与无序排放现象非常普遍,导致水环境中抗生素污染日益严重[1-2].传统的水处理方法(生物、混凝、过滤等)无法将水体中抗生素有效去除,导致大量抗生素进入水环境,对人体健康与生态安全造成严重威胁[3-4].阿莫西林(AMX)作为一种常见广谱抗生素类药物,被广泛用于人体与动物疾病治疗[5].但AMX在水相中极易形成性质更加稳定的聚合物,进一步增强了其被降解的难度.由于AMX 的大量使用以及其生物代谢能力较差等原因,某些水体中(比如医疗废水、制药废水等)AMX 浓度甚至高达μg/L～mg/L级别[6-8].而如何实现这些水体中高浓度AMX 的有效去除至关重要.

电催化氧化(EO)作为一种环境友好型水处理技术,无需化学药剂添加,高效、简便,适用于难生物降解的污染物去除,并且在AMX 的去除方面已有相关研究[9-12].AMX 在电催化初期过程中可能产生毒性更高的中间体,增强该类废水的毒性风险水平,因此电催化降解过程中需要保障AMX 的高效降解,并掌握AMX 在电催化降解过程中的毒性演变规律.阳极材料作为该技术的核心,对整个电催化处理过程起到重要作用[13-15].而高活性的电极更有利于AMX 的深度降解与矿化,可避免高毒性中间体的积累.Ti/PbO2属于“非活性电极”,耐腐蚀性强,催化性能较高,且材料经济易得,已被广泛用于难降解有机废水处理当中[16-18].然而,Ti/PbO2电极催化层表面粗糙度与比表面积较小,导致其催化涂层的活性位点与伏安电荷总量较少,不利于污染物催化降解效果提升.

基于此,本文采用电流梯级调控方式制备多催化位点的高效Ti/PbO2阳极,对模拟AMX 废水进行电催化降解,并以斜生栅藻作为受试体,结合量化毒理基因组学技术对AMX 在降解过程中的生态毒性与毒理进行评价与分析,以保障电催化降解过程中抗生素废水的安全排放.

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

本实验所用化学试剂购自国药集团化学试剂有限公司(除阿莫西林、乙腈为色谱纯外,其它药品均为分析纯),斜生栅藻购自中国科学院武汉水生生物研究所淡水藻种库, 编号为 FACHB-416 Scenedesmus obiliquus,去离子水由实验室级超纯水器(UPD-II-10T,西安优普仪器设备有限公司)制备,高纯(＞99.6%)钛片购自宝鸡钛业股份有限公司.

1.2 电极制备

将钛片裁剪为5cm×6cm 尺寸,并进行打磨、除油、刻蚀等基体预处理,随后采用传统刷涂热分解法添加Sb-SnO2中间层制得Ti/Sb-SnO2电极,具体操作步骤可参考文献[19].

以Ti/Sb-SnO2为阳极,相同尺寸的铜片为阴极,控制沉积液温度在65℃,首先在0.01A/cm2的电流密度下电沉积1h,并按设定程序立即调控电流密度大小为(0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.5, 0.7 与1.0A/cm2),保持5min,取出并用去离子水洗净,备用.电催化液组成:0.5mol/L Pb(NO3)2, 0.2mol/L Cu(NO3)2, 0.01mol/L NaF 与0.01g/L 十二烷基苯磺酸钠,采用浓HNO3将沉积液pH 值调至2.

1.3 电极表征及性能测试

制备电极的微观形貌采用扫描电镜(SEM,JEOL, JSM-6390A)进行观察;晶相结构采用X 射线衍射仪(XRD,德国布鲁克,D8ADVANCE)进行分析,扫描角度(2θ)为10°～80°.采用VersaSTAT4 型电化学工作站(德国,普林斯顿)对制备电极进行电化学性能测试,Ag/AgCl(饱和KCl)与铂片分别作为参比电极及对电极,电催化液为0.5mol/L H2SO4.循环伏安(CV)扫描范围为0～2.5V,扫速为50mV/s.交流阻抗(EIS)测试频率扫描范围为105～0.01Hz,振幅为5mV,测试电位为0V.以直流稳压电源控制电流水平(0.5A/cm2),在3mol/L H2SO4溶液中进行制备电极的强化寿命测试,控制电催化液温度在(35±2)℃,实时监控系统槽电压变化,当槽电压到达10V 时,即认为电极寿命结束.

1.4 斜生栅藻培养与藻密度及叶绿素a 含量测定

将斜生栅藻无菌转移至BG11 培养液中[20],并放入培养箱中驯化.培养条件:光照强度3000lx,光暗比12h:12h,温度(25±1)℃ ,每天摇匀4～5 次,其余时间静置培养.采用血球计数板对藻细胞进行显微计数,用紫外分光光度计进行OD 值测定,设置单波长为680nm.对OD 值和藻密度进行拟合,获得二者之间的函数关系.叶绿素a 含量测试采用乙醇萃取-分光光度法,具体步骤参考文献[21].

1.5 AMX 浓度测定

取水样,进行0.22μm 有机滤膜过滤,采用高效液相色谱仪(Aglient1100)进行AMX 浓度分析.色谱条件:C18 色谱柱,紫外检测器波长为228nm,流动相为90%超纯水+10%乙腈,停留时间为8min.

1.6 AMX 对斜生栅藻的生长抑制效果

取100mL 经高温灭菌的BG11 培养液,添加AMX 实现不同AMX 暴露浓度(1, 5, 50, 100, 300,500mg/L),加入生长对数期(藻密度2×105cells/mL)的斜生栅藻液10mL,放入培养箱内进行毒性测试.分别于24, 48, 72, 96h 取藻液进行OD680值和叶绿素a含量测定,按照公式1 计算AMX 对斜生栅藻藻密度与叶绿素a 抑制率.实验过程中设置无AMX 的空白对照组,并分别设置3 个平行样,整个测试过程中保持无菌环境.

式中:φ 表示藻密度或叶绿素a 的抑制率;A0与An分别表示空白对照组的藻密度或叶绿素含量与AMX暴露后的藻密度或叶绿素含量.

1.7 AMX 在电催化降解过程中毒理分析

为了使得实验效果更加显著,本研究中采取了高浓度的AMX 作为处理目标.采取超纯水配制300mg/L 的AMX 溶液,并加入0.1mol/L Na2SO4作为电解质.采取优选制备电极为阳极,相同尺寸铜片为阴极,电极有效面积为30cm2,电极间距为1.5cm,由直流稳压电源提供0.01A/cm2的电流密度,对体积为100mL 的AMX 溶液进行电催化,在150min内所设定时间间隔取样,并进行冷冻干燥提取有机成分,添加至100mL 经高温灭菌的BG11 培养液,加入10mL 对数期的斜生栅藻,以96h 培养为限,观测斜生栅藻生长抑制情况.同时,对不同电催化时间后提取的有机成分进行量化毒理基因组学测定,借助110 种带有不同启动子的E.coli K12MG1655(含低拷贝质粒、卡那抗性基因及绿色荧光标记基因)活细胞阵列的实时基因表达谱检测方法,通过显微细胞微孔成像系统对暴露于有毒物质的菌株测定其光密度(OD)及荧光强度(GFP),对所测得数据进行生物信息学分析,以每个基因及其综合转录效应指数(TELI)为量化依据,完成对环境污染物的毒性评估,具体步骤可参考文献[22-23]. TELI 是以110种带有特定启动子的E.coli 作为受体,通过检测有毒物质对不同类型基因应激表达的刺激程度,经过系列积分公式(2-3)计算得出的一个毒性水平量化指数.

式中:TELIgenei与TELItotal分别表示单基因与综合转录效应指数;I 表示诱导因子.

2 结果与讨论

2.1 电极表层形貌

表1 制备PbO2 电极的不同参数Table 1 The different parameters of selected PbO2 electrodes

图1 不同沉积电流密度下PbO2 电极的SEM 照片Fig.1 SEM images of PbO2 electrodes under different deposition current densities

由图1 可以看出,电极制备过程中沉积电流密度由0.01A/cm2增加至1.0A/cm2时,涂层颗粒由小变大,并且电极表层形貌由“四棱锥型”向“菜花状”转变.当沉积电流密度增加至0.7A/cm2时,涂层颗粒发生坍塌,形成粒径较小的均匀颗粒,经测试电极稳定性极差,因此后续未进行0.7 与1.0A/cm2电流密度下电极的相关研究.同时研究发现,在0.5A/cm2电流密度下制备的电极材料涂层较为疏松,结合力较弱,并存在涂层剥离的现象,容易导致电催化液向涂层内部的侵入,不利于电极材料的稳定性.造成这一现象的原因是因为PbO2晶粒随电沉积时间与电流强度而发育长大,电流强度过大会造成沉积过程加剧,PbO2颗粒在短时间内迅速堆叠、长大,造成涂层负载量增加,但同时也会降低涂层对沉积面的结合力,造成涂层剥离现象发生.经过精密天平称重,电流密度0.01～1.0A/cm2下制备的电极涂层总负载量分别为86.3, 90.1, 96.3, 92.1, 89.7, 82.5mg/cm2(表1).而较大的涂层负载量也有利于催化位点的增加以及电极寿命的延长.

2.2 电极表层晶型结构

图2 不同沉积电流密度下PbO2 电极的XRD 谱图Fig.2 XRD patterns of PbO2 electrodes under different deposition current densities

经XRD 分析(图2),不同沉积电流密度下PbO2电极的主要衍射峰位于25.4°, 31.8°, 36.2°, 49.0°,52.1°, 58.9°, 62.5°,分别对应β-PbO2的(110),(101),(200),(211),(220),(310)及(301)晶面,说明随电流密度的增加,电极表层晶型结构未发生改变,仍为β-PbO2.但可以明显地看到0.1A/cm2下的电极表层晶型发育最为良好,随沉积电流密度的继续增加,涂层晶型衍射峰强度降低,峰宽增大,结晶程度变差.推其原因是因为过大的电流强度影响到β-PbO2的结晶过程,晶体发育受阻,结晶度变差,而良好的晶型更有利于材料催化性能的提升.

2.3 循环伏安测试

图3 为不同PbO2电极在0.5mol/L H2SO4溶液中的循环伏安曲线.电极的催化活性与其催化活性位点多少有密切的联系,而循环伏安电量(q*)可以从一定程度上反映电极涂层本身活性位点的多少[24-26].通过对0.01～1.0A/cm2电流密度下制备的电极循环伏安曲线进行积分求得q*分别为0.079,0.094, 0.087, 0.216, 0.235, 0.103C/cm2.但0.3A/cm2电流密度下制备的电极稳定性较差,经过第二圈扫描后有部分涂层脱落,同时循环伏安最高电流密度由95mA/cm2降至17mA/cm2,曲线所包围的封闭面积(即伏安电量)极大减小.相比较而言,0.2A/cm2电流密度下制备的电极在进行多次扫描后仍具有较高的稳定性,同时也呈现较大的伏安电量,更有利于电极对污染物的电催化过程.推其原因是因为0.2A/cm2电流密度下制备的电极形貌成三维“菜花状”,同时具备较高的涂层负载量,二者综合提高了电极的催化位点数量与伏安电量.

图3 不同沉积电流密度下PbO2 电极的循环伏安曲线Fig.3 Cyclic voltammograms curves of PbO2 electrodes under different deposition current densities

2.4 交流阻抗测试

图4 为制备PbO2电极在0.5mol/L H2SO4溶液中的 Nyquist 图及拟合的等效电路(插图).经ZSimpWin 软件拟合发现,所有的测试电极均很好的符合了R1(C(R2W))模型(R1为溶液电阻;R2为传输电阻;C为双电层电容;W为扩散阻抗),其拟合数据列于表2.从图4 中可以看出,随着沉积电流密度的提高,电极的容抗弧明显减小.其中R2的大小可以反映出电荷传输的快慢,一般而言,R2数值越小,电极涂层上的电化学反应越容易进行,意味着电极的催化活性越高.测试过程中,0.5A/cm2电流密度下制备的电极容抗弧最小,但此电极性能不稳定.由表2 可知,0.2A/cm2电流密度下制备的电极R2仅为27.27ohm/cm2,同时具有最大的电容值(3.48×10-4F/cm2),说明此电极涂层具有较多的活性位点[27],与循环伏安结果相一致.

图4 不同PbO2 电极的Nyquist 图及等效电路示意Fig.4 The fitted curves of the different PbO2 electrodes in EIS and equivalent circuit model

除催化活性外,电极的稳定性也是评价电极质量的一个重要指标.对于PbO2电极,它在实际工作中使用寿命可达几年,甚至十几年.因此,为减少其测试时间,本文分别对不同电流密度制备的PbO2电极进行强化寿命测试,以评价电极的稳定性能(表1).由表1 可知,当沉积电流密度在0.01～0.2A/cm2时,电极强化寿命基本保持在90～100h 左右,但当沉积电流密度继续增加,电极强化寿命将发生急剧缩短,当沉积电流密度达到0.5A/cm2时,电极强化寿命降至15h左右.通过经验公式(式4)对电极在正常条件下的使用寿命进行评估.经推算,0.01～0.2A/cm2电流密度下制备电极在正常条件下(0.05A/cm2)的使用寿命约为9000h,已满足实际应用要求.

式中:SL 表示电极使用寿命;i 表示施加电流密度;n表示系数(一般在1.4～2 之间,此处取平均值1.7).

基于以上测试分析,综合考虑电化学性能与稳定性,优选出0.2A/cm2电流密度下制备的PbO2电极用于后续AMX 电催化降解,并对降解过程中的水质毒性演变过程进行分析.

表2 不同参数的拟合数据(EIS)Table 2 Simulated data of each parameter (EIS)

2.5 AMX 对斜生栅藻的生长影响

经origin 8.0 对斜生栅藻的藻密度(Y)与680nm处紫外吸收值(OD680,X)数据进行拟合,得到函数关系:Y=7.04×106X,R2=0.99029. 后续藻密度通过检测680nm 处的光密度按此公式进行转换获得.

图5 为不同浓度AMX 对斜生栅藻的生长抑制情况.由图5(a)可知,随着AMX 暴露浓度的升高,斜生栅藻的细胞生长受抑制程度随之增加,96h 的藻密度抑制率从1mg/L AMX 的31.6%提升至500mg/L AMX的53.9%.同时,随暴露时间延长,藻类生长抑制效应越明显,但在48h 的暴露时间下藻密度抑制率均有下降趋势.推其原因是因为斜生栅藻经初期暴露,在48h时对AMX刺激产生暂时性适应,藻细胞产生“自我防御”机制,但随暴露时间延长,AMX 药物被藻细胞大量吸收,引起“自我防御”机制崩溃,导致藻类抑制效果重新增强[28].由图5(b)可知,AMX 对斜生栅藻叶绿素合成抑制效果与藻密度抑制趋势大致相同,随着AMX 暴露浓度的增加,斜生栅藻叶绿素合成抑制率也呈现增强趋势,但叶绿素抑制率最高值为500mg/L AMX 的47.3%,略低于对藻密度的抑制程度.同时,随暴露时间延长,叶绿素合成受抑制程度逐渐增强.此外,研究发现AMX 对叶绿素合成表现为“低浓度促进,高浓度抑制”效果,与前人研究结果相一致[29-30].

有研究表明[31-32],抗生素在低浓度下可对藻类产生毒性刺激作用,进一步激活相关蛋白酶合成与合成基因表达,促进叶绿素的生成,同时降低藻细胞中叶绿素酶的活性以减缓叶绿素的降解,而藻细胞中叶绿素a 受抗生素的刺激反应更为敏感.

图5 不同浓度阿莫西林对斜生栅藻生长的影响Fig.5 Effects on the growth of Scenedesmus obliquus under amoxicillin with different concentrations

2.6 AMX 电催化降解效果与毒理分析

图6 为AMX 采用优选电极的电催化降解效果(插图:降解过程中的高效液相色谱图变化)及对斜生栅藻的生长抑制情况.由图6(a)可知,随电催化时间延长,水体中AMX 浓度逐渐下降,在150min 电催化时间内,AMX 的浓度从初始的300mg/L 降至136mg/L,去除率达到54.7%.该效果优于之前报道的Ti/RuO2电极在0.7A 较高电流条件下降解所呈现的51.6% AMX 去除率(本文中为0.3A),同时AMX在电催化过程中高效液相色谱图吸收峰强度降低,并且数量增加,原因是因为AMX 电催化过程中众多中间体的产生导致,这一现象与Ti/RuO2电极处理结果相一致[33].提取不同电催化时间内水样的有机成分进行斜生栅藻的生长抑制测试(图6(b)),结果表明,在150min 的电催化时间内,水样对斜生栅藻的生长抑制程度先升高后降低,在120min 时藻密度与叶绿素抑制率达到最高值,分别为56.8%与44.2%.推其原因是因为AMX 在电催化过程中浓度虽降低,但产生了某些高毒性中间体,导致其对斜生栅藻的抑制率增大.随着制备电极对AMX 的持续高效电催化,AMX与其中间体均不断被消除或转化为低毒性物质,从而引起水样对斜生栅藻的生长抑制程度减轻.

为进一步探究AMX 在电催化降解过程中的毒性机理,本文采用TELI 法对电催化过程中收集的有机成分进行毒理基因组学分析(图7).由图7(a)可知,AMX 电催化过程中的TELItotal值随电解进行先增大后减小,并在120min 电催化条件下达到最高值(2.61),其变化趋势与图6 中斜生栅藻的生长抑制情况一致.通常认为TELItotal值在1.5 以上所测试的物质具有显著毒性[34],通过AMX 降解过程中TELItotal值数据说明电催化过程中产生了毒性更高的中间体,并经150min 的持续降解,AMX 或中间体的浓度与毒性水平降低.对110 种基因应激表达热图进行分析(图7(b)),发现AMX 在降解过程中对细胞的氧化应激与蛋白质应激反应较为强烈,而膜应激、DNA应激与一般应激相应基因表达较温和. AMX 作为一种β-内酰胺类抗生素,主要通过作用于细胞壁上结合蛋白,激活机体内相关酶的表达,干扰细胞壁的合成,并对细胞内氧化还原反应产生强烈刺激[35]. 因此,AMX 在电催化过程中对细胞的氧化应激与蛋白质应激的基因表达最为强烈.此外,通过对比110 种基因表达强弱变化,也可反映出AMX 电催化降解过程中毒性先升高后降低的趋势,与前文结果一致.

图6 AMX 电催化降解效果及对斜生栅藻的生长抑制Fig.6 Degradation effect of AMX in electrocatalysis and its inhibition on growth of Scenedesmus obliquus

图7 AMX 电催化降解中的转录效应毒性及110 种基因表达应激效果Fig.7 Transcriptional toxicity during AMX electrocatalytic degradation and heat map of 110gene stress effects红:应激强烈;黑:应激温和

3 结论

3.1 电沉积电流密度对活性涂层形貌具有较大影响,随电流密度的升高,电极表层形貌由“四棱锥型”向“菜花状”转变,但晶相仍为β-PbO2,而具有三维结构的“菜花状”涂层形貌更有利于电极伏安电荷量提高以及膜阻抗的降低.

3.2 综合电化学性能与稳定性,优选出0.2A/cm2电流密度下制备的PbO2电极用于后续AMX电催化降解.随水体中AMX 浓度升高,斜生栅藻的藻细胞生长受到抑制,但对于叶绿素的合成呈现“低浓度促进,高浓度抑制”效果.

3.3 AMX 电催化降解过程中,斜生栅藻的生长受抑制程度(96h)先升高后降低,TELItotal值由最初1.54升至2.61,并经150min的持续电催化降为1.63.AMX在电催化降解中造成的细胞氧化应激与蛋白质应激最为明显,推测AMX 电催化降解产生的中间体对细胞中相关蛋白酶与氧化还原反应产生较大刺激所致.