李晓花 李 祯 台海川 刀会仙 段志航 赵彩云 林艳芳*

1.滇西应用技术大学傣医药学院，云南 景洪 666100；2.云南雅解傣药堂科技有限公司，云南 景洪 666100；3.西双版纳州傣医医院，云南 景洪 666100

感染性疾病是由病毒、衣原体、支原体、立克次体、细菌、螺旋体、真菌、寄生虫等致病微生物侵入人体导致的疾病，是危害人类健康的主要疾病[1]，临床常用抗生素治疗感染性疾病，具有杀菌抑菌和抗炎效果，但其毒性及滥用引起的二次感染及细菌的耐药性等问题已经成为全球性问题[2-3]。中药是我国传统医学发展的结晶，已经有多种中药临床用于感染性疾病的治疗，效果显著。中药治疗感染性疾病具有多靶点、抑菌谱广、毒副作用小、不易产生耐药性等特点，近年来引起越来越多学者关注[4]。傣医药是四大民族医药之一，具有2500多年的应用历史，其以“四塔”、“五蕴”为理论核心，具有独特和完整的理论体系，为傣族和边疆人民的繁衍生息作出了巨大贡献[5]。

本研究选取名老傣医林艳芳教授临床常用于感染性疾病治疗的7种傣药材，以大肠杆菌和绿脓假单胞菌作为指示菌，对选取的药材乙醇提取物用不同极性溶剂萃取，获得的提取物进行体外抑菌对比实验，为临床应用和产品开发提供依据。

1 材料

LB培养基(北京鼎国昌盛生物技术有限公司)，琼脂(美国Invitrogen公司)，葡萄糖(美国Sigma公司)，琼脂粉(日本Japan公司)，DMSO(美国Sigma公司)。

试剂均为分析纯。

1.2 供试菌种 菌种：绿脓假单胞菌(Pa.，博伟生物技术有限公司)，大肠杆菌(Ec.，天津赛尔生物技术有限公司)。

1.3 仪器设备 流水式粉碎机(DF-35，温州大德)，旋转蒸发仪(EV241，北京莱伯泰科仪器股份有限公司)，恒温水浴锅(HWS-24，上海一恒科学仪器有限公司)，电子天平(ME204，梅特勒-托利斯)，鼓风干燥箱(BGZ-246，上海博迅实业有限公司)，恒温摇床培养箱(ST20H，冠森生物科技上海公司)，超净工作台(HCB-1300V，青岛海尔特种电器有限公司)，高压灭菌锅(GI80TW，厦门致微仪器有限公司)，台式离心机(L420，长沙湘仪离心机仪器有限公司)。

2 方法[6-8]

2.1 提取物和阳性对照药的制备 取7种傣药材，打粉过20目筛，备用。分别称取100 g各种傣药材，加10倍量95%乙醇回流提取3次，每次2 h，合并提取液减压浓缩至无醇。提取物加适量热水混悬后，放置至室温，依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，获得乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位。萃取物及编号见表1。

表1 7种傣药材萃取物及编号

提取物溶液的配制：将各萃取物的水部分用超纯水溶解，母液浓度为250 mg/mL，稀释至终浓度25 mg/mL，0.22 μm过滤器过滤除菌备用；乙酸乙酯和正丁醇萃取部位用0.2%的DMSO-水溶解，母液浓度为250 mg/mL，稀释至终浓度25 mg/mL，0.22 μm过滤器过滤除菌备用。

阳性对照药的配制：准确称取25 mg对羟基苯甲酸乙酯，溶1 mL无水乙醇，制得25 mg/mL对照品溶液，0.22 μm过滤器过滤除菌备用。

2.2 试剂的配制

2.2.1 LB培养基的制备 10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物、氯化钠10 g，15 g琼脂粉，加蒸馏水至950 mL，混匀后，NaOH调pH至7.0，加水至1000 mL，121 ℃高压20 min。

首先，要让学生认识到学习地理的重要性。知识改变命运，地理的学习对于学生的未来有着重要影响的同时，对于日常生活也有很多帮助，要让学生认识到这一点。

2.2.2 营养胨培养基的制备 10 g蛋白胨、3 g牛肉膏、氯化钠5 g，15 g琼脂粉，加蒸馏水至 950 mL，混匀后，NaOH调pH至7.2～7.4，加水至1000 mL，121 ℃高压20 min。

2.2.3 菌液的制备 将4 ℃下保存的绿脓假单胞菌和大肠杆菌菌种，接种于营养琼脂培养基上，37 ℃ 孵育24 h，挑取菌落至琼脂液体培养基，摇菌培养12 h后，用生理盐水校正，与0.5麦氏比浊，将含菌量调至1.0×105cfu/mL。

2.2.4 含菌平板的制备 将15 mL灭菌琼脂培养基倒入无菌培养皿制平板，待平板完全凝固冷却，取100 μL稀释好的浓度1.0×105cfu/mL菌液至培养皿内，用无菌棒涂抹均匀，封口膜密封后放4 ℃冰箱备用。

2.3 滤纸片法测定抑菌圈 取灭菌双层圆形滤纸片(6 mm)，将滤纸浸在各样品溶剂中，设DMSO和纯水空白对照，对羟基甲酸乙酯阳性对照。取出滤纸片晾干，轻轻放在含菌平板的相应位置；贴好滤纸片的含菌平板倒置放入4 ℃冰箱静置2 h后，置于恒温培养箱37 ℃培养24 h；培养结束后，用精确度为1/10 mm的游标卡尺十字交叉测量抑菌圈直径，实验结果取3个平行组的平均值。抑菌圈越大，表示抑菌效果越好。

2.4 二倍稀释法测定最小抑菌浓度(MIC) 采用试管等倍稀释法，量取1.0 mL样品浓度为50 mg/mL的溶液加入到第一支试管中，再加入1 mL灭菌培养基；从第一支试管中取出1 mL溶液，滴加到第二支试管中，依此类推至第九管。第10管含有2 mL培养基，并弃去1 mL；同时以1 mL相同浓度的DMSO和纯水代替药物提取物与培养基混合做空白对照，相同浓度的对羟基苯甲酸乙酯为阳性对照；采用微量加样器向各试管中均加入制备好的菌悬液100 μL(1×105cfu/mL)，摇匀后放入培养箱中37 ℃培养24 h，取出试管充分震荡混匀，并对各个试管进行检查，用肉眼观察期浑浊度，以此来判断有无菌生长；对照管中菌呈现浑浊状生长，溶液开始出现澄清的最低浓度确定为样品的MIC值。

2.5 最小杀菌浓度(MBC)的测定 自样品浓度高于MIC值(包括MIC浓度)的试管中各吸取100 μL混悬液分别滴加到灭菌的平板培养基上，涂布均匀，培养箱中37 ℃培养24 h，肉眼观察结果，菌落数小于5个或无菌落生长的最低样品浓度确定为MBC值。

3 结果与分析

3.1 各提取物均具有抑制大肠杆菌和绿脓假单胞菌生长的活性 抑菌圈的检测是为了对比在同种浓度下不同提取物的抑菌活性大小，抑菌圈越大，说明抑菌活性越好。表2的检测结果显示：7种解药提取物的不同极性萃取部位均具有抑制大肠杆菌和绿脓假单胞菌的活性，抑菌圈检测结果显示，对绿脓假单胞菌抑制效果最好的为MLDJY-2，即勐腊大解药正丁醇萃取部位，抑菌圈为(2.80±0.07)cm，与阳性对照药效果相当；效果最差的为ZYL-3，即竹叶兰水部位，抑菌圈为(1.21±0.04)cm。

表2 7种傣药材萃取物对大肠杆菌和绿脓假单胞菌抑菌圈检测结果

3.2 最小抑菌浓度(MIC)的测定 最小抑菌浓度是指在特定环境下孵育24 h，可抑制某种微生物出现明显增长的最低药物浓度，试验时肉眼未见细菌生长的最低药物浓度即为MIC。同一细菌对不同药物的敏感性用MIC值衡量，值越小，说明越敏感，其抗菌药物的作用越强。检测结果显示：七种傣药解药不同极性萃取物均可检测最小抑菌浓度，MLDJY-1、MLDJY-2和DY-2、BHCMD-2对大肠杆菌的最小抑菌浓度为0.195 mg/mL，与阳性对照药效果一致；DY-2和MLDJY-2在0.781 mg/mL浓度下显示出最绿脓假单胞菌的最小抑菌浓度。

表3 7种傣药材对大肠杆菌和绿脓假单胞菌最小抑菌浓度(MIC/mg/mL)检测结果

3.3 最小杀菌浓度(MBC)的检测 最小杀菌浓度(MBC)是最初的试验活菌数减少99.9%或以上所需要的最低抗菌药物的浓度。由表5实验结果显示，七种傣药解药品种不同极性萃取物对大肠杆菌的最小杀菌浓度均优于对绿脓假单胞菌的最小杀菌浓度。MLDJY-2对大肠杆菌的MBC为3.125 mg/mL，效果最好；MLDJY-1、MLDJY-2、DY-2和HCP-1对绿脓假单胞菌的MBC为6.25 mg/mL；BHCMD-3、TGC-3和YGC-3均为检测出对大肠杆菌和绿脓假单胞菌的MBC。

表4 7种傣药解药对大肠杆菌和绿脓假单胞菌最小杀菌浓度(MBC/ mg/mL)检测结果

4 讨论

大肠杆菌(Escherichia coli)，又叫大肠埃希氏菌，是条件致病菌，是人和动物肠道中最主要和数量最多的一种细菌，主要寄生于大肠内。在一定条件下可以引起人和多种动物发生胃肠道感染或尿道等多种局部组织器官感染[9]。绿脓假单胞菌(Pesudomonas pyocyaneum)，是一种革兰氏阴性菌、好氧、呈长棒形的细菌，广泛分布于自然界及正常人皮肤、肠道和呼吸道，由于对抗菌素有较强的抗性，已成了医院内感染的重要细菌，是临床上较常见的条件致病菌之一[10]。

本实验的研究结果为傣药材抗菌活性和作用机制的研究奠定了前期基础，为傣药产业的现代化研究提供探索途径。