刘佳宇 ， 温慧之 ， 范阔海 ， 尹 伟 ， 孙耀贵 ， 孙盼盼 ， 李宏全

(1. 山西农业大学动物医学学院 ， 山西 太谷 030801 ； 2. 山西农业大学实验动物管理中心 ， 山西 太谷 030801)

CD40L是肿瘤坏死因子受体超家族(Tumor necrosis factor receptor superfamily，TNFRSF)[1]的成员。在体内，CD40L和CD40构成共刺激分子,为抗原呈递细胞、B细胞及T细胞的活化提供第2信号，启动细胞免疫和体液免疫，是特异性免疫应答激活的重要条件[2-3]。研究表明，将CD40L基因与抗原基因串联构建共表达载体，制备DNA疫苗或表达为融合蛋白接种到宿主体内，能够增强抗原的免疫原性[4-5]。另外，重组CD40L与疫苗联合使用也能增强疫苗的免疫效果[6-7]。鉴于此，本试验构建毕赤酵母(Pichiapastoris)表达体系，体外表达重组鸡CD40L，将重组鸡CD40L与新城疫LaSota疫苗联合免疫7日龄SPF鸡，评价重组鸡CD40L与鸡新城疫LaSota疫苗联合免疫的效果。

1 材料与方法

1.1 试验动物、菌株及质粒 7日龄SPF鸡，购自北京生泰尔生物科技有限公司。毕赤酵母(Pichiapastoris)X-33菌株和穿梭质粒pwPICZalpha由本实验室保存。

1.2 主要试剂及仪器 Ni SepharoseTM6 Fast Flow，购自美国GE公司；阳离子交换树脂(Poros 50 HS)，购自美国Applied Biosystems公司；新城疫LaSota灭活疫苗和4% 605佐剂，均购自北京生泰尔生物科技有限公司；总超氧化物歧化酶(T-SOD)测定试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)测定试剂盒和丙二醇(MDA)测定试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所。基因导入仪(SCIENTZ-2C型，宁波新芝生物科技有限公司)；层析柱(XK-16型，美国GE公司)。

1.3 试验方法

1.3.1 重组鸡CD40L的表达纯化 根据NCBI登录的鸡CD40L基因序列(Gene ID:395485)和毕赤酵母(Pichiapastoris)的密码子偏好性，将鸡CD40L基因进行优化后合成。合成的鸡CD40L基因序列与穿梭质粒pwPICZalpha连接，利用电转化的方法导入毕赤酵母X33。……