王轶男 ， 胡诗悦 ， 陈洪涛 ， 金春梅 ， 金 一 ， 于龙政

(1.延边大学农学院 ， 吉林 延吉 133002 ； 2. 长春市动物疫病预防控制中心 ， 吉林 长春 130000 ；3. 山东省新泰市泉沟镇人民政府 ， 山东 新泰 271207)

牛瑟氏泰勒虫(Theileriasergenti)是一种泰勒属的血液原虫，通过破坏红细胞发挥致病作用[1]。病牛早期出现不愿行走、虚弱等症状，重症病例出现黄疸、食欲废绝、不能站立等严重症状[2]。伴随养牛产业的扩大，在我国不同地理区域不断发现牛瑟氏泰勒虫感染。肉牛产业是吉林省近年来的重点发展产业，因此要有效防治该病的发生，减少和降低养牛业的损失。P33基因是牛瑟氏泰勒虫的功能基因，基因序列全长868 bp[3]。

牛瑟氏泰勒虫免疫学检测方法主要包括间接免疫荧光试验(IFA)、乳胶凝集试验(LA)、平面聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、分子生物学诊断等[4-6]。用以上方法都能诊断出该病，但仍存在特异性较差、敏感性较低、扩增产物的污染导致假阳性等问题，因此不能有效防控该病。鉴于上述原因，本试验旨在建立牛瑟氏泰勒虫的TaqMan荧光定量PCR和SYBR Green荧光定量PCR检测方法，为其快速检测提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 样本 采集吉林省延边朝鲜族自治州1个规模养牛场的牛血液样品作为检测血样，并于-20 ℃冷冻保存。

1.2 主要试剂 Blood DNA Midi Kit、Plasmid Maxi Kit、Gel Extraction Kit等，均购自OMEGA Bio-Tek生物技术公司；rTaqDNA聚合酶、ExTaqDNA聚合酶、dNTP、限制性内切酶EcoRⅠ和Hind Ⅲ、pMD 18-T Vector克隆载体、SYBRPremixExTaqⅡ、PremixExTaq等，均购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.3 引物设计和合成 本试验应用软件Primer Express设计引物，并根据荧光定量PCR引物和探针设计原则，用软件Primer Premier和Oligo分别评估引物和探针。……