杨立均，鲁雅雯，丁 超，金维环，郭红祥

(1.河南省烟草公司 驻马店市公司,河南 驻马店 463000；2.河南农业大学 生命科学学院，河南 郑州450002)

脂氢过氧化物裂解酶(HPL)是一类膜结合的血红素-铁硫蛋白，属于细胞色素P450(CYP74)蛋白家族[1]。HPL参与植物体内脂氧合途径，是脂氧合酶(LOX)下游的一个关键酶，可将LOX催化形成的氢过氧化脂肪酸裂解形成含氧酸和短链挥发性醛类[2-3]。依据催化底物的过氧基位置不同，HPL被划分为3类同工酶，第1类同工酶(也命名为13-HPL)特异催化13位过氧基断裂，第2类同工酶(9-HPL)催化9位过氧基断裂，第3类同工酶(9/13-HPL)催化9位或13位过氧基断裂[4]。这3类同工酶在植物种类中有不同的分布，如杏和梨中含有9-HPL基因，烟草、番茄、拟南芥等植物中含有13-HPL基因，黄瓜、水稻中含有9/13-HPL基因[5]。

自从第1个HPL基因从甜椒中克隆出来，人们陆续从拟南芥、甜瓜等多种植物中得到HPL基因的cDNA序列，对HPL基因的研究也逐渐加深。13-HPL蛋白具有细胞色素P450家族的普遍特征：结构域A(I-螺旋区)在酶与底物相互作用中起作用，结构域D为血红素结合区；N-端具有由15～20个疏水氨基酸组成的跨膜信号序列。HPL参与植物生长发育的众多过程，其催化产物是植物特异气味的成分，如C6和C9挥发物对果蔬气味非常重要，C6醛与植物青草气味有关，C9醛则会增加浓郁的香味。黄瓜中的主要风味物质如烯醛、烯醇、丙醛、己醛等均由HPL催化的代谢产生，枸橘中的HPL基因转入生菜后能够提高风味和品质[6-7]。目前，关于HPL的研究大多集中于改善植物风味方面[8-11]，另外，有研究发现，干旱胁迫会增加黄瓜HPL基因的表达，因此，HPL在提高植物抗旱等抗逆性方面也将有较好的应用[7,12]。

烟草是一种重要的经济作物，其产量和品质一直被人们关注。干旱是影响烟草产量和品质的一个重要因子。干旱胁迫能导致烟株叶片活性氧积累、膜脂过氧化程度加剧，从而增加丙二醛(MDA)含量；同时烟株也会启动抗氧化防御系统，增强过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)等抗氧化酶的表达与活性，增加脯氨酸的积累，进而提高抗旱能力[13]。我国部分烟区常因连续干旱导致烟叶中香气物质含量减少，造成严重的经济损失。HPL催化生成的挥发性短链醛和含氧酸具有特殊气味，是影响烟草品质的重要指标；同时，HPL也被报道参与植物的干旱胁迫响应，故考虑通过调节烟草HPL的表达来提高烟草的品质和抗旱性。从烟草中克隆HPL基因(NtHPL)，获得HPL基因的过表达烟株，并进行抗性功能研究，以期提高烟草抗逆性、减少逆境对烟草品质的影响，增加其经济价值。

1 材料和方法

1.1 菌株、载体及主要试剂

大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α感受态细胞、农杆菌GV3101感受态细胞、过表达载体pCAMBIA 1300均由河南省高等学校转基因植物基础与应用重点开放实验室保存。反转录试剂盒、DNA Marker、T4 DNA连接酶购于Takara公司，2×TaqPlus Master Mix购自Vazyme公司，DNA胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、产物纯化试剂盒购自上海生工生物工程股份有限公司，荧光定量试剂盒购于诺唯赞公司，限制性内切酶XbaⅠ和SmaⅠ购自Thermo Fisher公司，酵母粉、胰化蛋白胨购自Solarbio公司，其他均为国产分析纯试剂。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，测序由华大基因有限公司完成。

1.2 植物材料及处理

在大田烟草旺长期，选取生长状况良好的K326烟株，分别取根、茎、叶组织，液氮速冻后放于-80 ℃冰箱中保存，用于NtHPL组织表达特异性分析。

将野生型烟草K326和过表达NtHPL烟草种子播种育苗盘中,置于光照培养箱(26～28 ℃,相对湿度70%,光照16 h/黑暗8 h)中培养，至烟苗四叶期时移入花盆中(直径15 cm，高22 cm)。五叶期后，随机各选取长势相同的10株烟株,每株用200 mL 20% PEG-6000溶液进行干旱胁迫处理，24 h后取叶片检测MDA、脯氨酸含量以及POD、SOD活性。

选取长势一致的野生型K326烟株进行如下处理：对照组(喷施清水)、茉莉酸甲酯(MeJA)组(喷施4.0 mmol/L MeJA溶液)、乙烯利组(喷施4.0 mmol/L乙烯利溶液)、脱落酸(ABA)组(喷施0.1 mmol/L ABA水溶液)、水杨酸(SA)组(喷施2 mmol/L SA溶液)、机械损伤处理组(用剪刀剪伤叶片)，24 h后取顶端第2片叶，液氮速冻后保存于-80 ℃冰箱，用于NtHPL表达分析。

1.3 方法

1.3.1 生物信息学分析 对克隆得到的烟草HPL基因序列用NCBI网站在线工具ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)寻找开放阅读框；选择番茄(Lycopersiconesculentum)、拟南芥(Arabidopsisthaliana)、苜蓿(Medicagosativa)、树棉(Gossypiumarboreum)、辣椒(Capsicumannuum)、土豆(Solanumtuberosum)、黄瓜(Cucumissativus)、石榴(Psidiumguajava)、大麦(Hordeumvulgare)、玉米(Zeamays)、葡萄(Vitisvinifera)和大豆(Glycinemax)的HPL蛋白氨基酸系列， 运用DNAman软件与烟草HPL蛋白氨基酸进行序列比对，同时分析烟草HPL蛋白分子质量、等电点；采用Chlorop 1.1软件分析HPL的细胞定位[14]。用PSIPRED方法预测NtNPL蛋白的二级结构、信号肽和跨膜区[15],用蛋白质三级结构在线分析工具(https://web.expasy.org/protparam/)预测NtNPL蛋白的空间结构。

1.3.2 烟草HPL基因的克隆与转基因烟株的获得 按照Trizol法提取烟草叶片总RNA，按照反转录试剂盒说明书进行操作得到cDNA。根据HPL基因cDNA序列设计引物，上下游引物分别插入XbaⅠ和SmaⅠ酶切位点(下划线部分)，引物序列：NtHPL-F：5′-GCTCTAGAATGTCCACAATAATGGCGAAAATGAT-3′；NtHPL-R：5′-TCCCCCGGGTCAACTGGCTTTTTTCACAGATGTGAT-3′。以cDNA为模板进行克隆。PCR循环条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸92 s，共30个循环；72 ℃最终延伸10 min。

将纯化的PCR产物和pCAMBIA 1300载体进行XbaⅠ和SmaⅠ双酶切，回收目的基因片段和线性载体片段后用T4 DNA连接酶进行连接，连接条件为16 ℃过夜。将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态，经抗性筛选、菌液PCR验证，将阳性克隆扩大培养、提取质粒，冻融法转化农杆菌(GV3101)感受态细胞，36～48 h后挑取单克隆进行菌液PCR检测，将检测成功的菌液进行保菌。叶盘法转化K326烟草无菌苗获得转基因植株HPL-1300。

1.3.3 生理指标检测 MDA含量采用硫代巴比妥酸法(TBA)测定，SOD活性采用氮蓝四唑还原法测定，POD活性采用愈创木酚法测定，脯氨酸含量采用酸性茚三酮法测定[16-17]。

1.3.4 烟草HPL基因表达分析 烟草总RNA提取采用TRIzon试剂，以反转录得到的cDNA为模板，以烟草β-Actin(GenBank：AF126810)作为内参基因，使用美国BioRad公司实时荧光定量PCR仪检测HPL基因表达，每个样品设置3个重复,采用2-ΔΔCt算法进行基因表达水平分析。所用引物如下，NtActinF:CTGAGGTCCTTTTCCAACCA，R:TACCCGGGAACATGGTAGAG；NtHPLF:GTTTTGAGTTGTGGCAGCTA，R:GAGTATCACACAAGGGGGAG。

2 结果与分析

2.1 NtHPL基因的生物信息学分析

以反转录得到的cDNA为模板，以NtHPL-F、NtHPL-R为引物从烟草中克隆得到的NtHPLcDNA序列全长为1 494 bp(图1)，利用NCBI上ORF Finder工具发现，该序列包含完整的开放阅读框，编码1个由497个氨基酸组成的蛋白质，分子质量为55.7 ku，等电点为8.41。将cDNA序列与NtHPL基因组DNA序列进行比对，发现编码区包含2个外显子(450 bp和1 044 bp)和1个内含子(10 938 bp)。采用Chlorop 1.1软件分析表明，NtHPL蛋白定位于叶绿体中，N-端含有叶绿体转运肽。图2显示NtHPL蛋白为跨膜蛋白，分别在299—319位和463—479位氨基酸有2个跨膜区，N-端含有21个氨基酸组成的信号肽。

1.DL2000 DNA Marker; 2.NtHPL

图2 NtHPL蛋白的信号肽与跨膜预测结果

图3显示NtHPL蛋白与其他物种的HPL蛋白序列比较结果，NtHPL蛋白具有细胞色素P450蛋白家族的普遍特征，在C-端具有4个保守的结构域A、B、C、D，结构域A主要在与底物相互作用中起重要作用，结构域D中含有13-HPL特有的NKQC序列，主要负责与血红素分子结合；在N-端有CYP74亚家族蛋白质的保守序列LPxRxIPGSYGxPxxGP。NtHPL蛋白还包含有与血红素分子以及血红素铁相互作用的保守氨基酸。从图4可以看出，NtHPL蛋白主要由α-螺旋结构组成。

Domain A、B、C、D是P450家族蛋白C-端的保守区；下划线表示P450家族CYP74亚家族在N-端的保守区；圆点表示与血红素分子相互作用的氨基酸；星号表示与血红素铁相互作用的半胱氨酸

下划线表示N-端信号肽，红色表示α-螺旋结构，黄色表示β-片层结构，灰色表示卷曲结构

2.2 NtHPL基因的表达分析

从图5可以看出，在烟草旺长期，NtHPL基因在叶中的表达量远远高于根和茎，表明该基因主要存在于叶中。机械损伤、MeJA和SA处理后，叶片NtHPL表达量明显提高，分别是对照的5.31、10.94、4.26倍，说明NtHPL响应机械损伤胁迫和MeJA信号。机械损伤能够产生茉莉酸(JA)信号，SA能诱导植物对病毒、真菌、细菌引起的病害产生抗性。有研究表明，植物发生机械损伤、病虫害时，绿叶挥发物的生成会增多，绿叶挥发物是由LOX和HPL共同作用生成，所以NtHPL与烟草的抗逆响应有关。乙烯、ABA和干旱处理后，叶片NtHPL表达量有不同程度的提高，分别是对照组的2.33、2.54、4.17倍，表明NtHPL与干旱等非生物胁迫及信号刺激响应有关。

A.烟草旺长期不同部位NtHPL的表达； B.NtHPL在逆境胁迫及激素类信号物质作用下的表达

2.3 NtHPL过表达烟株的获得

采用CTAB法提取叶片DNA，进行转基因烟株检测，由图6可以看出，在野生型K326中没有检测到条带，而转基因烟草中检测到1 622 bp的条带，表明NtHPL过表达载体成功转入K326中。从图6可以看出，NtHPL过表达烟株(HPL-1300)中HPL表达量明显上升，是K326的3.6倍，说明获得的NtHPL转基因烟株过表达效果较好。

1：DL2000 DNA Maker； 2：野生型K326； 3：NtHPL过表达烟株

2.4 NtHPL基因的抗旱功能初步分析

MDA是细胞膜脂过氧化的主要产物,常用来评价细胞膜的受伤害程度。图7显示，干旱处理后，野生型K326和转基因烟株的MDA含量都升高了，但野生型K326的MDA含量是NtHPL过表达烟株的近5倍，表明干旱胁迫造成K326烟株脂质过氧化程度明显高于转基因烟株，即转基因烟株具有更强的维持细胞膜稳定性的能力。脯氨酸是植物体细胞内重要的渗透调节物质，植物可通过积累游离脯氨酸防御干旱胁迫。图7显示，干旱胁迫能够增加烟株的脯氨酸含量，但转基因烟株HPL-1300的脯氨酸含量明显高于K326烟株，表明转基因烟株防御干旱胁迫的能力更强。POD和SOD是植物体内重要的抗氧化酶，它们能清除活性氧自由基，抑制膜脂过氧化，减轻逆境对细胞膜的伤害。图7显示，干旱处理后，野生型K326和转基因烟株HPL-1300的POD和SOD活性均有升高，但K326烟株中这2种酶的活性明显高于转基因烟株，分别是转基因烟株的1.8倍和2.2倍，表明转基因烟株中POD和SOD被诱导的程度低于野生型K326，即转基因烟株中的活性氧积累少，其抗旱能力大于K326烟株。

图7 干旱胁迫对烟株脯氨酸和MDA含量及抗氧化酶活性的影响

3 结论与讨论

脂肪酸代谢是植物生长发育中重要的代谢过程，HPL是脂氧合途径下游的酶，其催化产物是植物绿叶挥发物的主要成分，既可作为植物的气味物质又能作为信号分子参与植物的抗逆反应。大多数植物HPL蛋白的N-端都具有跨膜信号序列，但也存在较大差异。烟草HPL蛋白是一种13-HPL。研究表明，番茄13-HPL活性存在于叶绿体囊膜上，其N-端没有典型的叶绿体转运肽[18]；BATE等[19]推测，拟南芥13-HPL的N端有叶绿体转运肽。本研究发现，烟草HPL蛋白主要表达在叶片部位，预测其N-端含有1个由21个氨基酸组成的叶绿体转运肽。HPL基因的表达受到众多胁迫因素的诱导，13-HPL催化的产物愈伤素是伤口愈合反应中的信号分子，能促使创伤的细胞和组织快速愈合[20-25]。本研究发现，除了干旱、ABA、SA等因素诱导NtHPL的表达外，机械伤害和MeJA都能显著提高NtHPL的表达水平，进一步表明NtHPL能参与烟草的伤口愈合反应过程。

干旱是我国烟草种植面临的一种严重的非生物胁迫因素，提高烟草抵抗非生物胁迫的能力一直是烟草栽培与育种的努力方向。当干旱胁迫发生时,植物因气孔关闭，限制了二氧化碳的摄取,使得光呼吸过程中电子传递受阻，从而产生大量活性氧和自由基，对植物细胞大分子和生物膜造成损害，增加脂质过氧化程度。植物体内存在维持活性氧与自由基平衡的一系列调节机制，抗氧化酶是清除体内活性氧的一类重要酶，植物可通过转录因子、蛋白质磷酸化等途径上调抗氧化酶的表达与活性，降低活性氧对植物的伤害[26-27]。植物HPL产物中的醛类不仅可通过还原反应清除多余的活性氧，而且醛类物质中与羰基直接相连的α-碳原子上具有较活泼的氢，能与受胁迫影响产生的活泼自由基结合，中止自由基的作用，从而阻止氧化的进行，起到了较强的抗氧化作用[28]。本研究发现，干旱胁迫后，过表达NtHPL烟草的脯氨酸含量明显高于非转基因对照烟株，而MDA含量、SOD和POD活性的变化则相反，表明NtHPL过表达能够提高烟株的抗干旱胁迫响应能力，降低干旱胁迫对烟株的伤害，但具体机制尚需进一步研究。