李 艳，郭怡德，勾红潮，卞志标，孙铭飞，蔡汝健，宋 帅，蒋智勇，楚品品，徐民生，杨东霞，李春玲*

(1.广东省农业科学院 动物卫生研究所，广东 广州 510640；2.广东省畜禽疫病防治研究重点实验室，广东 广州 510640；3.农业农村部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站，广东 广州 510640)

1 材料与方法

1.1 供试病毒株ASFV SY18毒株、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪圆环病毒2型(PCV2)均由广东省畜禽疫病防治研究重点实验室保存。

1.2 主要试剂和仪器克隆载体pMD19-T vector、Ex Taq以及Premix Ex Taq(Probe qPCR)购自TaKaRa公司，其他试剂均购自国内生化试剂厂商。主要仪器有荧光定量PCR仪(LightCycler96)和紫外分光光度计(BioTek)。

1.3 引物和探针设计参考ASFV SY18毒株(MH713612)P72基因核苷酸序列设计特异性引物(P1、P2)和探针，用作实时荧光定量PCR的引物和探针，序列见表1。

表1 特异性引物和探针信息

1.4 标准质粒样品的制备含有ASFV SY18毒株P72基因序列的质粒标准品pMD19-T-ASFV-P72由本实验室构建，其中P72基因片段由生工生物(上海)工程股份有限公司合成。阳性质粒用紫外分光光度计测浓度和纯度，D260值定量浓度，并转换成拷贝数：拷贝数=浓度×阿伏伽德罗常数/(1个碱基对的平均相对分子质量×总长度)，阿伏伽德罗常数为6.02×1023。已知拷贝数的重组质粒10倍梯度稀释后作为标准品，-20℃保存备用。

1.5 实时荧光定量PCR反应体系及条件优化采用20 μL反应体系，退火温度设置为58.0，58.5，59.0，59.5，60.0，60.5，61.0，61.5℃ 等8个温度梯度。反应体系：2×Premix Ex Tag 10 μL，P1 0.6 μL(0.3 μmol/L)，P2 0.6 μL(0.3 μmol/L)，探针0.3 μL(0.15 μmol/L)，DNA模板1 μL，用ddH2O补充至20 μL。引物浓度200，300，400，500，600 nmol/L，探针浓度50，100，150，200，250 nmol/L，分别稀释5个浓度梯度。选取最低的Ct值。循环条件：预变性95℃10 min；95℃15 s，60℃ 30 s，扩增45个循环。

1.6 实时荧光定量PCR标准曲线的建立将……