杨梓超，王育良，左 晶

0引言

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是由于胰岛素代谢异常所引发的视网膜局部组织缺氧、缺血，导致视网膜病变，是糖尿病最常见的微血管并发症之一，可导致视力障碍及致盲[1]。DR的基本病理改变是血-视网膜屏障破坏，导致视网膜新生血管生成[2]。DR的发生、发展与多种生长因子和细胞因子有关，其中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)及其受体血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)是参与DR发生、发展过程中最重要的因子[3]。血管生成素-1(angiopoietin-1，Ang-1)能与VEGF相互调节，维持血管内皮细胞的成熟及稳定，并促进血管生成[4]。

中药蒲黄具有活血化瘀、抗炎和抗凝等功效，目前临床上已广泛用于治疗2型糖尿病[5]。有研究表明，蒲黄总黄酮(pollen typhae total flavone，PTF)可通过β抑制蛋白2介导的信号传导改善胰岛素诱导的葡萄糖摄取[6]。然而目前对于蒲黄提取物应用于DR的治疗研究较少，因此本研究通过蒲黄提取物治疗DR大鼠并探讨其保护作用，为临床治疗DR提供理论依据。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1实验动物选择SPF级雄性大鼠55只，8～12wk，体质量180～240g，购自中国科学院昆明动物研究所，合格证号：SCXK(滇)K2016-0001。本研究通过江苏省中医院实验动物伦理委员会审批。

当前，国内外齿圈制造工艺普遍存在能耗大、环保不达标等诸多弊端，研发、制造水平均处于较低的水准。而该工艺方案可降低齿圈加工能耗，节约劳动成本，有着广阔的推广应用前景。

1.1.2实验主要试剂与仪器蒲黄提取物(西安赛奥生物技术有限公司提供)；链脲佐菌素(美国Sigma公司)；DAB显色试剂盒(碧云天生物科技有限公司)；Trizol(美国Invitrogen公司)；VEGF、VEGFR2、Ang-1、GAPDHqRT-PCR上下游引物(上海生工公司)；兔抗鼠VEGF多克隆抗体、兔抗鼠VEGFR2多克隆抗体、兔抗鼠Ang-1多克隆抗体(均购自北京博奥森生物技术有限公司)；山羊抗兔二抗(美国LI-COR公司)；ELISA试剂盒(南京建成生物工程研究所)。ACCU-CHEK® Mobile逸动型血糖仪与血糖试纸(上海罗氏制药有限公司)；ABI 7500型实时荧光定量PCR、MultiskanTMFC全自动酶标仪、iBrightTMCL1500成像系统(中国赛默飞世尔科技有限公司)；Allegra X-64R高速台式冷冻离心机(美国Beckman Coulter公司)；DM750显微镜(德国Leica公司)；DW-86L626 -80℃超低温冰箱(中国海尔集团公司)。

1.2方法

1.2.1建立模型和分组随机选取45只大鼠给予高脂饲料灌胃14d，采用一次性尾静脉注射链脲佐菌素(STZ；50mg/kg)建立糖尿病模型。于STZ注射72h后测定大鼠空腹血糖，选取空腹血糖≥16.7mmol/L的大鼠作为糖尿病大鼠。继续饲养1wk后，随机选择5只大鼠进行HE染色观察视网膜病理变化，视网膜发生病变则表明建模成功。将剩余40只大鼠随机分为DR组(给予等量的生理盐水灌胃)、实验A组[给予50mg/(kg·d)的蒲黄提取物灌胃]、实验B组[给予100mg/(kg·d)的蒲黄提取物灌胃]和实验C组[给予200mg/(kg·d)的蒲黄提取物灌胃]，治疗1wk后麻醉处死，采集各组大鼠视网膜及外周血进行后续实验。另选择10只大鼠作为对照组(正常饲养，不做任何处理)。

1.2.2各组大鼠空腹血糖测定各组大鼠处理后，尾静脉取血，采用血糖仪检测各组大鼠血糖。

1.2.3 HE染色观察各组大鼠视网膜病理学检查大鼠麻醉处死后取眼球，去除角膜、晶状体、玻璃体，取出视网膜组织并用0.9%生理盐水漂洗、滤纸、吸干，放入4%多聚甲醛中固定48h，然后进行脱水、石蜡包埋、切片。病理切片厚度为4μm。将病理切片放置于65℃烘箱2h后，依次放入二甲苯20min、无水乙醇、95%乙醇、90%乙醇、85%乙醇、75%乙醇、50%乙醇各5min。苏木素、酒精-伊红染色。中性树脂封片，镜下观察视网膜病理改变。

1.2.4 ELISA检测各组大鼠血清中IL-6和TNF-α含量将大鼠麻醉处死，眼球取血2mL，静置30min后4℃，4000r/min离心10min，取上清，并按照试剂盒说明书分别检测各组大鼠血清中IL-6、TNF-α含量。

1.2.6qRT-PCR法检测视网膜组织VEGF和VEGFR2及Ang-1 mRNA表达水平Trizol法提取视网膜组织总RNA，酶标仪检测其浓度后将总RNA逆转录获得cDNA，采用SYBR Green I实时荧光定量PCR方法检测VEGF、VEGFR、Ang-1基因的表达水平。引物由上海生工公司设计合成，引物设计如下：VEGF上游5’-CCTGGCTTTACTGCTGTACCT-3’，下游5’-GCTGGTAGACGTCCATGAACT-3’；VEGFR2上游5’-GCCGGCATGGTCTTCTGTGAG-3’，下游5’-GGGGCTCAGGACCACATCATAA-3’；Ang-1上游5’-TAAATCAAACATCCCCTCTT-3’，下游5’-AGGTGTCCAGCTCTTCCT-3’；GAPDH上游5’-ATTCCATGGCACCGTCAAGGCTG-3’，下游5’-GTGGTGAAGACGCCAGTGGACT-3’。反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共40个循环，最后72℃延伸10min。每个样本重复检测3次。每组VEGF、VEGFR2和Ang-1基因的相对表达量按公式(2-△△Ct法)计算。

2结果

2.1各组大鼠一般情况及空腹血糖比较在建模过程中，DR组大鼠不明原因死亡2只，实验A组和实验B组各有1只大鼠因血糖未达到标准予以剔除，其余大鼠均建模成功。对照组大鼠皮毛有光泽，精神好，行动敏捷；DR组大鼠精神萎靡，皮毛枯黄无光泽，行动迟缓；各实验组大鼠精神有改善，皮毛略有光泽，行动较DR组敏捷。与对照组空腹血糖(6.20±0.65mmol/L)相比，DR组(24.93±4.62mmol/L)、实验A组(20.82±2.44mmol/L)、实验B组(17.48±1.90mmol/L)、实验C组(16.22±1.17mmol/L)大鼠空腹血糖均显著升高，差异有统计学意义(F=76.332，P<0.05)；与DR组相比，各实验组大鼠空腹血糖均有下降，且实验B组和实验C组大鼠空腹血糖显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)，而实验A组与DR组相比差异无统计学意义(P>0.05)。

图1 HE染色观察各组大鼠视网膜形态变化(×100) A：对照组：正常饲养，不做任何处理；B：DR组：给予等量的生理盐水灌胃；C：实验A组：给予50mg/(kg·d)的蒲黄提取物灌胃；D：实验B组：给予100mg/(kg·d)的蒲黄提取物灌胃；E：实验C组：给予200mg/(kg·d)的蒲黄提取物灌胃。

表1 各组大鼠血清中IL-6和TNF-α含量比较

2.2各组大鼠HE检测视网膜病理变化HE结果显示，对照组大鼠视网膜各层次清晰，细胞排列紧密；DR组大鼠视网膜光感受器细胞层结构被明显破坏，细胞出现水肿、间隙增宽；实验A组大鼠视网膜各层细胞稀疏，排列紊乱，细胞水肿比较明显；实验B组大鼠视网膜各层细胞排列较整齐，少量细胞结构被破坏，可见部分空泡；实验C组大鼠视网膜各层细胞排列整齐，细胞形态正常，可见少许空泡，见图1。

2.3各组大鼠血清中IL-6和TNF-α含量比较与对照组相比，DR组和各实验组大鼠血清中IL-6、TNF-α含量均显著升高，差异有统计学意义(FIL-6=250.230，PIL-6<0.05；FTNF-α=1123.995，PTNF-α<0.05)；与DR组相比，实验B组和实验C组大鼠血清中IL-6、TNF-α含量均降低，差异具有统计学意义(P<0.05)，而实验A组与DR组相比差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

图2 各组大鼠VEGF mRNA表达水平 a P<0.05 vs对照组；c P<0.05 vs DR组；e P<0.05 vs 实验A组。

2.4各组大鼠视网膜组织VEGF和VEGFR2及Ang-1的蛋白及mRNA表达水平比较与对照组相比，DR组和各实验组大鼠视网膜组织VEGF、VEGFR2和Ang-1的蛋白及mRNA表达水平均显著升高，差异有统计学意义(蛋白：FVEGF=162.629，PVEGF<0.05；FVEGFR2=197.990，PVEGFR2<0.05；FAng-1=135.654，PAng-1<0.05。mRNA：FVEGF=151.168，PVEGF<0.05；FVEGFR2=425.986，PVEGFR2<0.05；FAng-1=76.676，PAng-1<0.05)；与DR组相比，实验B组和实验C组大鼠视网膜组织VEGF、VEGFR2和Ang-1的蛋白及mRNA表达水平均降低，差异具有统计学意义(P<0.05)，而实验A组与DR组相比差异无统计学意义(P>0.05)，见图2～5和表2。

图3 各组大鼠VEGFR2 mRNA表达水平 a P<0.05 vs对照组；c P<0.05 vs DR组；e P<0.05 vs 实验A组。

图4 各组大鼠Ang-1 mRNA表达水平 a P<0.05 vs对照组；c P<0.05 vs DR组；e P<0.05 vs 实验A组。

图5 各组大鼠VEGF、VEGFR2和Ang-1蛋白表达。

表2 各组大鼠VEGF和VEGFR2及Ang-1蛋白表达

3讨论

DR是一种由于长期高血糖引起的微血管病变，是一种涉及多种细胞因子的非常复杂的视网膜病变[7]。高血糖状态是DR发生的始动因素，可引起细胞内外代谢发生紊乱，导致组织结构出现改变，从而导致DR的发生及发展。STZ糖尿病模型是用于研究DR病理机制及防治策略的常用动物模型[8]。本研究给予高脂饲料灌胃14d，采用一次性尾静脉注射STZ(50mg/kg)建立DR模型，结果发现DR组大鼠精神萎靡，皮毛枯黄无光泽，行动迟缓，且所有大鼠空腹血糖均≥16.7mmol/L，与对照组相比显著升高；HE结果显示，对照组大鼠视网膜各层次清晰，细胞排列紧密；DR组大鼠视网膜光感受器细胞层结构被明显破坏，细胞出现水肿、间隙增宽。提示本研究DR模型大鼠建立成功。DR的发病机制非常复杂，炎症、氧化应激等在DR的发生发展中具有重要作用。据报道，促炎因子TNF-α、一氧化氮(NO)和细胞内黏附分子-1(ICAM-1)的升高表达导致血视网膜屏障(BRB)功能的破裂；而减少TNF-α，NO和ICAM-1等促炎因子的表达可削弱BRB功能并减轻视网膜炎症，缓解DR的发展[9]。本研究结果发现，与对照组相比，DR组大鼠血清中IL-6和TNF-α含量均显著升高，相关研究表明DR患者房水中炎性细胞因子IL-1β、IL-6、IL-8、IL-17A和TNF-α的水平可能与DR的发病机制，严重程度和预后有关[10]，提示炎症因子在DR的发生、发展中起重要作用，从炎症角度可能为DR开发新的诊断和治疗策略提供重要价值。

VEGF信号在眼部病理性血管生成中起关键作用，VEGF被认为是介导DR病理生理改变的重要因素[11-12]。而Ang-1是形成成熟血管所必需的，其可通过结合内皮特异性受体酪氨酸激酶2起作用，降低内皮细胞通透性，并调节VEGF的效应，维持内皮细胞稳态[13]。有研究显示，VEGF/VEGFR2在调节DR的发生发展中起着重要作用，VEGF通过与VEGFR2的高亲和力结合并诱导VEGFR2的磷酸化而发挥促血管生成活性；阻断VEGF-VEGFR2及其下游ERK1/2和p38信号通路，可以抑制视网膜内皮细胞血管生成[14]。Kang等[15]研究发现，高糖刺激导致糖尿病眼视网膜组织中VEGF、VEGFR2水平及Ang-1、Ang-2等促血管生成蛋白持续升高，表明高血糖会损害视网膜血管，这可能会引起视网膜血管营养不良，视网膜细胞损伤，导致缺血性视网膜病变。本研究结果发现，与对照组相比，DR组大鼠血清视网膜组织VEGF、VEGFR2和Ang-1的蛋白及mRNA表达水平均显著升高，以上结果与高糖刺激小鼠视网膜组织中观察到的结果一致，提示VEGF、VEGFR2和Ang-1高表达可导致DR的发生。

PTF可以降低2型糖尿病大鼠的血糖，并能通过调控β-arrestin-2介导的信号转导功能改善胰岛素抵抗和血脂紊乱[16]。有研究显示，PTF能促进骨骼肌细胞和脂肪细胞葡萄糖摄取和利用，降低2型糖尿病大鼠血浆IL-6和骨骼肌组织SOCS-3水平，改善其胰岛素敏感性，具有潜在的抗糖尿病作用[17]。另有研究发现，蒲黄花粉(TP)可用于治疗眼底出血；而蒲黄花粉多糖(TPP)治疗可通过抑制炎症反应和改善血液循环改善DR[18]。本研究发现，各实验组大鼠精神有改善，皮毛略有光泽，行动较DR组敏捷。与DR组相比，实验B组和实验C组大鼠空腹血糖均有下降，视网膜病理变化均有不同程度的改善；且大鼠血清中IL-6、TNF-α含量、视网膜组织VEGF、VEGFR2和Ang-1的蛋白及mRNA表达水平均降低，提示中、高剂量蒲黄提取物可有效改善DR大鼠空腹血糖及视网膜病理变化，可能是通过降低炎性细胞因子和视网膜组织VEGF、VEGFR2和Ang-1的表达起到保护作用。

综上所述，蒲黄提取物可下调DR大鼠炎症水平及VEGF、VEGFR2和Ang-1的表达，从而改善视网膜组织病变。因此，蒲黄提取物在DR的治疗和改善预后具有重要的临床意义。