宋瑞其，呼尔查，樊新丽，翟雪洁，李 敏，郝蕴伟，巴音查汗*

(1.新疆农业大学 动物科学学院，新疆 乌鲁木齐 830052;2.新疆农业大学 动物医学学院，新疆 乌鲁木齐 830052)

马梨形虫病是由马泰勒虫(Theileriaequi)或驽巴贝斯虫(Babesiaequi)寄生于马属动物(马、驴、骡和斑马)红细胞、淋巴细胞内引起的一种蜱传原虫病[1]。主要呈发热、可视黏膜黄染、下颌淋巴结肿大、流黏液性鼻液和喜卧等症状。马梨形虫病在欧洲南部、亚洲、俄罗斯、非洲、古巴、中南美洲及美国南部一些地区均有相关报道，其中，在我国新疆大部分地区(如准噶尔盆地、塔里木盆地边缘区、阿勒泰、塔城、博乐、精河、和静、乌苏、乌鲁木齐、昌吉、奇台、且末、若羌、库尔勒及伊宁市周边诸县等[2-8])均有该病的报道。根据国际兽疫局(OIE)(2011年)报告，仅2010年全世界就有27个国家流行马梨形虫病的报道[9-10]，据联合国粮食和农业组织的数据显示，2013年世界范围内马匹存栏量约为1.12亿匹，其中全球大约90%的马属动物分布在马梨形虫病流行地区[11-12]。该病传播媒介为硬蜱，可传播该病的有草原革蜱、森林革蜱和边缘革蜱等 3属17种蜱虫[13]。作为蜱传马梨形虫病的疫区，“传染源(带虫马)—媒介蜱虫—易感动物(健康马)”已构成了该病的传播链，无疑是增加了对该病的防控难度，给养马产业造成了一定的经济损失且存在巨大的潜在隐患。为保持新疆马产业健康良好的发展，提高边远地区“马背民族”等农牧民的生活水平，对马梨形虫病流行因素的分析研究对该病的防控显得尤为重要。

1 材料与方法

1.1 样品采集采样地点为伊犁昭苏地区。于2016年4月份，随机采集38只体表蜱虫(吸血不明显)及周围环境中175只游离蜱虫样品；于2016年7月份，针对33匹杂交肉马，分别采集33份全血和19份蜱虫样品(1匹马体表采集的所有蜱虫算作1份)。

1.2 试剂与主要仪器组织全血DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)公司；胶回收试剂盒购自美国OMEGA 公司；2×Taq PCR Green Mix 购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；DL2000 DNA Marker和pEASY-T1克隆载体购自北京全式金生物有限责任公司；体视显微镜购自德国Leica公司；RA-DIAL20台式高速离心机购自西班牙ORTOALRESA公司；ND-2000c型紫外分光光度计购自美国Thermo sciencetific公司;DK-600A型电热恒温水浴锅购自上海一恒科学仪器有限公司；PCR仪购自美国 Bio-Rad 公司；DYY-Ⅲ-5型电泳仪购自北京六一公司。

1.3 蜱虫的鉴定对2016年4月采集的蜱虫使用毛笔进行清洗，刷除蜱体表的毛或皮屑等异物，根据盾板形状将蜱虫按雌、雄分类，再根据假头基、须肢、盾板珐琅彩、气门板形状以及足基节等特征对所采集的蜱种进行形态鉴定[14]，并观察、拍照记录结果。

1.4 PCR检测及基因测序

1.4.1引物的设计与合成 根据GenBank中马泰勒虫18S基因序列与驽巴贝斯虫Bc48基因序列设计引物，DNA的提取和基因的PCR扩增，具体见参考文献[15]。

1.4.2基因测序 用胶回收试剂盒回收纯化PCR 产物，连接pEASY-T1 载体上，转化到 DH5ɑ 大肠杆菌感受态细胞中；将转化后的菌液涂布在含Kana+( 100 mg/L)的培养基上培养，次日挑取单个菌落，提取质粒，委托上海生物工程技术服务有限公司采用双向法进行测序。

1.5 数据分析利用公式“感染强度=(携带蜱虫的马匹数+携带梨形虫的体表蜱虫数+携带梨形虫的马匹数)/被调查马匹数×100%”对马匹感染寄生虫强度进行分析；利用NCBI中BLAST 在线软件对测序后基因序列进行同源性分析；利用SPSS Statistics Version 22.0软件对数据进行差异显著性分析；应用Mega 5.0软件进行系统进化树分析；使用DNAMAN软件进行基因序列的同源性比对。

2 结果

2.1 蜱虫的鉴定经形态学鉴定，分别鉴定出草原革蜱(D.nuttalli)、森林革蜱(D.silvarum)和边缘革蜱(D.marginatus)等3种革蜱。草原革蜱：体卵圆形(5.0 mm×3.0 mm)；盾板前窄后圆，前侧与中测珐琅彩较浓；气门板逗点状，背突较直而短；足交粗壮，胫节Ⅳ、前跗节腹面各具有3个细长的齿突；假头短，假头基矩形；第Ⅰ基节外距短于或等于内距之长。森林革蜱：体卵圆形[4.5 mm×(2.9 ～3.0) mm]；盾板上珐琅斑彩明显；足Ⅰ转节背距末端尖细；雌虫足Ⅳ基节外距末端超出该节后缘；雄虫气门板背突达到盾板边缘。边缘革蜱：体卵圆形(4.8 mm×3.0 mm)；盾板前窄后圆，呈块状间隔分布；气门板大，长逗点形，背突稍弯，伸至盾板边缘；足交粗壮，Ⅳ股节、胫节、前跗节腹面各具有3个细长的齿突；假头基矩形，侧缘几乎平行，后端向内微弯；第Ⅰ基节外距明显短于内距(图 1)。

2.2 马体表和牧场的不同种类蜱虫携带马梨形虫的分析对2016年4月份采集的马体表和周围牧场蜱虫鉴定出3种硬蜱：草原革蜱、森林革蜱和边缘革蜱。草原革蜱的优势度最高，体表和牧场分别占52.6% 和 56.0%；另外，对不同蜱虫携带梨形虫病原检测结果显示，马驽巴贝斯虫的感染率相对高于马泰勒虫(表 1)。

2.3 不同年龄马匹感染蜱和梨形虫的分析对2016年7月份所研究的33匹马按照不同年龄进行分析，在2～10岁的马匹中，2岁马匹的感染强度达到最高(366.7%)，其次为7和10岁马匹，8岁马匹感染强度最低(100.0%)；对马源性、蜱源性梨形虫的感染率分析，马自身携带马泰勒虫病(90.9%)的感染率高于马驽巴贝斯虫病(36.4%)，然而，马体表蜱虫携带梨形虫病则相反：马驽巴贝斯虫病(51.5%)感染率高于马泰勒虫病(24.2%)(表 2)。

图1 昭苏马场及其蜱虫鉴定结果

表1 来自马体表和牧场的不同种类蜱虫携带马梨形虫的分析

表2 不同年龄马匹感染蜱和其携带梨形虫的分析

2.4 马匹染蜱率及其携带梨形虫的分析马匹年龄与携带梨形虫及其媒介蜱之间差异显著(P<0.05)，马携带蜱虫数量与马源性、蜱源性泰勒虫的感染三者之间均存在显著差异(P<0.01) (图 2)。

2.5 带虫马阳性DNA重组质粒的测序及比对分析根据对马匹、体表蜱虫和环境游离蜱虫所携带梨形虫检测，对所检测的马泰勒虫(Te18S基因)和驽巴贝斯虫(Bc48基因)阳性样品进行测序，依据测序结果与国内外其他地区相关基因序列比对，建立系统发育树进行分析。结果显示，马源性和蜱源性的马泰勒虫基因差异较大，同源性为98.71%；而不同溯源的驽巴贝斯虫之间的差异较小，同源性为99.13%(图 3)。

**P<0.01( Student's t-test)

A.系统进化树分析;B.DNAMAN比对分析。▲.马泰勒虫Te 18S基因；●.马驽巴贝斯虫Bc48基因

3 讨论

当今世界发现的蜱种有870多种，在中国就有110余种，蜱类的地理分布研究，大多是以省为单位进行调查。在青海省有蜱类27种，我国北部山地有9种，柴达木盆地有8种，青南高原有19种[16]；江苏省有2属4种[17]；贵州省有2科5属12种[18]；陕西省有26种。蜱类分布有一定的地理特征[19]，东北三省的蜱类现已知2科7属21种，其中辽宁省18种，吉林省13种，黑龙江省11种[20]。陈泽等[21]对我国蜱类的地理分布调查结果显示，中国的蜱类分布特点呈点状和带状分布。新疆、甘肃、西藏、云南、福建、台湾等省区分布种类最多(30～46种)，而河南、江西等省区分布种类最少(4～6种)，其中新疆共记载2科9属50余种(亚种)[22]。最常见且对人和家畜危害性最大的是硬蜱科[23]，蜱所寄生的宿主动物泛多，被认为是仅次于蚊媒的病原传播载体[24]。

硬蜱在吸食宿主血液的过程中不仅会刺激叮咬部位发生炎症反应，严重者亦可引起宿主麻痹性瘫痪，而且它还可以作为许多病原体的传播媒介，传播一些常见的原虫等蜱传病[25]。蜱及蜱传病所引起的经济损失巨大，据联合国粮农组织(FAO)数据统计显示，仅硬蜱给畜牧业造成的经济损失，每年高达70亿美元以上[26-27]。

昭苏县位于伊犁河谷，雨水充足，有着丰富的草场资源，马匹数量很多，主要是以放牧形式进行饲养；然而丰富的草场植被资源为大量蜱虫的孳生提供了有利条件。另外，畜牧业生产使得单位面积内家畜密度升高，直接增加了动物宿主数量和活动强度，从而对蜱产生聚集作用[28]。因此，在放牧形式下马匹更加有利于被携带病原的硬蜱侵袭、叮咬，造成蜱传马梨形虫病流行[29]，并造成一定的经济损失。马梨形虫病主要集中发生于2―6月份和9―11月份两个时间段[30]。该病的流行与带虫媒介硬蜱的孳生和消长等活动规律密切相关，具有一定的地区性和季节性[31]。不同地区感染率的差异可能与环境、蜱种差异性、动物的迁徙及皮革贸易中蜱的传播作用有关[32]。另外，马匹携带马梨形虫病的概率与马匹的年龄也有一定的关系，幼龄和老龄马匹由于免疫力低，感染率略高[33-34]。

根据此次在新疆昭苏地区的调查结果显示，在所采集的蜱虫样品中，有草原革蜱、森林革蜱和边缘革蜱，其中草原革蜱和森林革蜱数量所占比例较大。同一区域的不同种类蜱的活动季节和活动时间的长短有很大的差别[35]，这可能是造成草原革蜱和森林革蜱在此次采集数量较多，而边缘革蜱的数量较少的原因。根据马体表和牧场的不同种类蜱虫数量及其携带梨形虫病原率分析，蜱虫数量越多其携带马梨形虫病的概率就越高。对昭苏地区不同蜱虫携带梨形虫病原的检测结果显示，马源性泰勒虫感染率高于驽巴贝斯虫，而蜱源性之间的感染率恰好相反(无论是马体表还是草原游离蜱虫)，这可能与两种原虫的生活史的不同有关[36]。

根据昭苏的不同年龄段分析马匹感染强度，其中幼驹的感染强度高于成年马，幼驹较易感[37]，这可能由于成年马匹被媒介蜱虫和或原虫感染过，促使机体产生了特异性抗体，减少了再次被感染的可能性[38]。经数据统计学分析，马匹年龄与携带梨形虫及其媒介蜱之间差异显著(P<0.05)，马携带蜱虫数量与马源性、蜱源性泰勒虫的感染三者之间均存在显著性差异(P<0.01)。故马梨形虫病的流行与马匹年龄以及马、硬蜱的带虫率均有着密切的关系，进一步验证了硬蜱的活动，特别是携带梨形虫的硬蜱流行对该病的传播起着至关重要的作用。

另外，根据马源性和蜱源性梨形虫之间系统进化树分析，马源性和蜱源性泰勒虫基因差异较大，同源性为98.71%；而不同溯源的驽巴贝斯虫之间的差异较小，同源性为99.13%。两种原虫在传播的过程中均存在遗传变异。昭苏地区马梨形虫病的流行与马匹年龄、媒介蜱数量、种类及其携带梨形虫率等因素均有关联性，这为当地进一步了解和防治该病提供理论依据。