张永福，徐仕琴，荆赞革，莫丽玲，黄 丽

(昆明学院 农学与生命科学学院，云南 昆明 650214)

占地壳总质量7%～8%的铝[1]在pH值大于5的土壤中，主要以不被植物吸收的硅酸盐或氧化物的形式存在[2]，不危害植物，但在pH值小于5的酸性土壤中，大量Al3+被释放并被植物所吸收，对植物造成伤害[3]。酸性土壤在我国南方地区分布较广，酸雨频发和生理酸性化肥的滥用，导致日趋严重的土壤酸化和铝毒害问题。葡萄(VitisviniferaL.)是世界广泛栽培的大宗果树之一，原产于中亚地区，对我国南方的酸性土壤适应性差，易受到铝毒威胁。张永福等[4]发现，葡萄在铝胁迫下植株生长受抑，芽片黄化，根系活力下降且变黑。作物的耐铝性在不同种甚至同种不同品种中均有显著差异[5-6]，可进行耐铝种质资源的筛选，筛选出的耐铝种质资源可进一步培育成耐铝的优良品种。

铝对作物的危害首先是阻碍其根系的生长和抑制根系对营养元素的吸收，进而导致叶片无机营养元素含量减少，引起抗氧化酶活性降低，光合速率下降，最终造成减产[7-16]。自然界中，有十余种元素是作物生长发育必需的无机营养元素，这些元素对铝胁迫的反应不尽相同，前人的研究揭示了铝胁迫抑制作物根系对N、P、K的吸收，进而导致叶片N、P、K含量下降[17]。可见，耐铝性强者在铝胁迫下其根系的吸收能力强于耐铝性弱者，进而使其叶片中的无机营养元素含量高于耐铝性弱者[18-19]。此外，植物根系大量吸收和积累铝元素是造成铝毒害现象的根源，铝胁迫下体内积累铝元素少者更有利于降低铝毒害作用。由于铝胁迫下不同葡萄种质资源对各无机营养元素的反应不尽相同，仅通过少数几种无机营养元素含量来鉴定其耐铝性局限性很大，鉴定结果不够客观准确。为寻找一种能够客观准确地评价作物种质资源抗逆性的方法，前人采用能够准确确定各指标权重的主成分分析法，把具有一定关系的多个变量转换成少数几个新的综合变量，再算出每份种质资源的隶属函数值，加权后得出各种质资源耐铝性的综合评价值[20-21]，此法亦适合对作物进行耐铝性评价。

因为铝胁迫对葡萄无机营养的吸收、运输及分配的影响是错综复杂的，需要综合多个指标进行评价、归类和筛选不同种质资源耐铝能力的强弱，其结果才较为可靠。近年来，主成分分析法和隶属函数法已应用在谷子[20]、胡麻[22]、油菜[23]、大麦[24]等作物的抗逆性鉴定中，但至今仍未见在葡萄耐铝鉴定中有报道。鉴于此，以云南省野生和引种栽培的26份不同来源的葡萄种质为材料，通过测定铝胁迫下各葡萄种质叶片中无机营养元素的含量，采用主成分分析、隶属函数和聚类分析等多种方法，基于各自无机营养元素含量，对葡萄不同种质资源进行耐铝性鉴定，从无机营养的角度建立葡萄耐铝性鉴定、筛选及评价方法，为葡萄耐铝品种的选育奠定理论基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

选用的26份葡萄种质资源：东亚种有蘡薁(泰山-1，Vitisbryoniaefolia‘Taishan-1’)、山葡萄(通化-3，V.amurensis‘Tonghua-3’)、刺葡萄(高山-2，V.davidii‘Gaoshan-2’)，野生种毛葡萄(V.quinquangularis，缩写VQ)和小叶葡萄(V.sinocinerea，缩写VS)；美洲种群内杂种有SO4(V.berlondieri×V.riparia‘SO4’)、贝达(V.riparia×V.labrusca‘Beta’)；欧美杂种有水晶(V.vinifera×V.labrusca‘Shuijing’)、红玫瑰(V.vinifera×V.labrusca‘Hongmeigui’)、巨峰(V.vinifera×V.labrusca‘Kyoho’)、玫瑰蜜(V.vinifera×V.labrusca‘Meiguimi’)、巨玫瑰(V.vinifera×V.labrusca‘Jumeigui’)、黑提无极(V.vinifera×V.labrusca‘Heitiwuji’)、夏黑(V.vinifera×V.labrusca‘Summer Black’)、超级无核(V.vinifera×V.labrusca‘Chaojiwuhe’)、黑玫瑰(V.vinifera×V.labrusca‘Heimeigui’)；欧山杂种有北醇(V.vinifera×V.amurensis‘Beichun’)和左优红[(V.amurensis×V.vinifera)×V.amurensis‘Zuoyouhong’]；欧亚种有红地球(V.vinifera‘Red Globe’)、黑提(V.vinifera‘Heiti’)、红比勒特(V.vinifera‘Hongbilete’)、赤霞珠(V.vinifera‘Cabernet Sauvignon’)、白牛奶(V.vinifera‘Bainiunai’)、黑加仑(V.vinifera‘Blackcurrant’)、京秀(V.vinifera‘Jingxiu’)、玛丽欧(V.vinifera‘Mario’)。

1.2 试验设计

试验在2017—2018年进行，26份试验材料种植在云南省昆明学院农学实践园大棚内。栽培方式为无土栽培，基质按V(泥炭)∶V(珍珠岩)∶V(蛭石)=2∶1∶1的比例混合好后装入直径30 cm、高30 cm的营养钵中，每钵装4 kg。在定植葡萄苗前参照考廖伯寿等[25]的方法对基质进行酸化处理，并用铝处理液浇透基质。然后挑选1年生、健壮、无病虫害的扦插苗定植于营养钵中，每钵植1株。

在前期不同铝浓度对葡萄生长胁迫研究的基础上，设置10 mmol/L铝胁迫[Al2(SO4)3，pH=4.0]和1/2 Hoagland’s营养液对照(CK)2个处理，10 mmol/L Al2(SO4)3处理液用1/2 Hoagland’s营养液配制。每份葡萄种质定植10盆，5盆用于铝胁迫处理，5盆用于对照处理，试验重复4次。铝胁迫处理60 d，期间根据环境条件和植株需水状况，每隔2～3 d不同处理分别浇500 mL的铝处理液和1/2 Hoagland’s营养液。

1.3 测定项目和方法

供试样品为健壮、成熟、无病虫害的叶片，采摘后用蒸馏水清洗干净后烘干、磨碎，过孔径0.212 mm标准筛，筛下的粉末用H2SO4-H2O2在Multiwave PRO微波萃取仪中消煮后，用于测定各无机营养元素含量。测定的12种元素包括N、P、K、Ca、Mg、Fe、Mn、Zn、B、Mo、Cu、Al。用纳氏试剂法测定N含量，其余11种元素含量均用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)分析系统测定。

1.4 数据处理

选用SPSS 22.0软件对试验数据进行差异显著性检测、相关性分析、主成分分析、聚类分析和回归分析。利用各项指标的耐铝系数与耐铝性综合评价值(D值)建立最优回归方程，计算公式如下：

与耐铝性呈正相关的指标，如N、P、K、Ca、Mg、Fe、Mn、Zn、B、Mo、Cu含量的耐铝系数为胁迫下的指标值与非胁迫下的指标值的比值；与耐铝性呈负相关的指标，如Al含量的耐铝系数为非胁迫下的指标值与胁迫下的指标值的比值。变幅 =(耐铝系数-1)×100%。

各种质资源的每个综合指标的隶属函数值的计算公式：U(Xj)=(Xj-Xmin)/(Xmax-Xmin)，j=1,2……n。式中,Xj表示第j个综合指标，Xmin和Xmax分别表示第j个综合指标的最小值和最大值。

2 结果与分析

2.1 26份葡萄种质资源12种无机营养元素的耐铝系数及相关性

根据26份葡萄种质资源铝胁迫处理与对照叶片12种无机营养元素的测定结果，计算各性状的耐铝系数(表1)。不同葡萄种质资源的耐铝系数差异极显著者有N、P、Ca、Mg、Fe、Mn、Zn、B、Al含量。在铝胁迫下，各葡萄种质资源的叶片无机营养元素均受到不同程度的影响，锌、硼、钼、铜含量的变幅分别为-62.0%～276.5%、-68.1%～252.8%、-92.2%～132.6%和-75.7%～286.8%。供试葡萄种质资源叶片各无机营养元素含量的变化幅度不同，若仅根据某一元素的耐铝系数来评价耐铝性，其结果太片面。此外，不同元素在葡萄耐铝性中所起的作用也不同，因此，直接利用这些元素含量来评价各葡萄种质资源的耐铝性结果准确性不高。从相关系数矩阵(表2)上也可看出，不同营养元素的耐铝系数间均存在或大或小的相关性，致使其所呈现的信息相互重叠，同时各元素在葡萄种质资源耐铝性中所起的作用亦不相同，直接利用这些元素含量来评判各葡萄种质资源的耐铝性结果不可靠。

表1 26份葡萄种质资源12种无机营养元素的耐铝系数Tab.1 Aluminum tolerance coefficient of 12 inorganic nutrient elements in 26 grape germplasm resources

表2 12种无机营养元素耐铝系数的相关系数矩阵Tab.2 Correlation matrix of Al-tolerance coefficients of 12 inorganic nutrition elements

2.2 26份葡萄种质资源12种无机营养元素的主成分分析

利用SPSS 22.0软件对26份葡萄种质资源的12种无机营养元素的耐铝系数进行主成分分析(表3)，前5个综合指标的贡献率(CR)分别为37.729%、21.714%、11.156%、8.110%和6.386%，累计贡献率达85.095%，其余可忽略不计。把原有的12个单项无机营养指标转变成5个各自独立的、全新的综合指标，这5个指标代表了原有指标85.095%的信息量。决定第1主成分大小的主要是K、Ca、Mg、Mn含量等4个性状分量；决定第2主成分大小的主要是P、Mn、Zn、Al含量等4个性状分量；决定第3主成分大小的主要是N、Fe、Mo含量等3个性状分量；决定第4、5主成分大小的主要是Cu、B含量等2个性状分量。

表3 各综合指标的系数及贡献率Tab.3 Coefficients of comprehensive index and their contribution rate

2.3 基于无机营养的26份葡萄种质资源耐铝性综合评价和聚类分析

分别利用上述公式计算各种质资源所有综合指标的隶属函数值(U值)及权重(IW)，并通过U值和权重计算耐铝综合评价值(D值)(表4)。根据D值的大小来判断各种质资源耐铝性的强弱，即D值越大，耐铝性越强。黑提、黑玫瑰、红地球、小叶葡萄的D值较大，耐铝性较强。

采用欧氏距离和最大距离法对D值进行聚类分析(图1)，从聚类图上可看出,葡萄不同种质资源的耐铝性，图1从虚线处将26份葡萄种质资源分为3类。第1类为泰山-1、黑提无极、水晶、玫瑰蜜、赤霞珠、红玫瑰、夏黑、超级无核、白牛奶、红比勒特等10份种质资源；第2类为通化-3、京秀、巨峰、北醇、玛丽欧、高山-2、毛葡萄、贝达、巨葡萄等9份种质资源；第3类为小叶葡萄、红地球、黑玫瑰、黑提、SO4、黑加仑和左优红等7份种质资源。

表4 26份葡萄种质资源的综合指标值、权重(IW)、U(X)值、D值和预测值(P)Tab.4 The comprehensive index(CI) value,index weight(IW),U(X) value,D value and prediction value(P) of 26 grape germplasm resources

2.4 基于无机营养元素筛选葡萄耐铝性鉴定指标

采用逐步回归的方法，以12个无机营养耐铝系数为自变量，以D值为因变量，进行回归分析，获得能够进行耐铝性预测或评价的数学模型，即最优回归方程。该方程为D=-0.019+0.111X3+0.143X5+0.106X8+0.025X9(F=129.032**，R2=0.985)，式中，X3、X5、X8、X9分别指代K、Mn、Zn、B含量。26份种质资源的D值与耐铝预测值(P值)相关性极显著，r=0.989**，表明用此方程对葡萄种质资源的耐铝性进行预测准确性和可信度高，预测结果可靠。由该方程可知，在12种无机营养元素中，K、Mn、Zn、B这4种元素对葡萄种质资源耐铝性有显著影响。今后在葡萄耐铝性鉴定中，仅需要测定这4种元素，鉴定工作大大简化。

3 结论与讨论

3.1 葡萄耐铝性鉴定的方法

铝胁迫对葡萄生长的影响几乎涉及葡萄生长发育的方方面面，对不同葡萄种质资源耐铝性强弱进行评价和筛选的过程就是耐铝性鉴定。作物发生铝毒害的重要原因之一就是铝毒干扰作物根系对无机营养的吸收，使作物发生缺素症[18]，如有报道铝毒导致作物缺氮症和缺钾症的发生[17]，及铝毒影响作物对磷、钙元素的吸收，且一致认为铝会与作物体内的磷结合形成沉淀而引起缺磷症，及铝与钙竞争细胞膜上的钙结合位点而导致缺钙[19]；此外，尽管铝胁迫下作物体内无机营养元素的积累量可作为作物耐铝性评定的重要指标，但铝胁迫下不同作物种质资源对某一种元素的反应不尽相同，难以用一种或少数几种元素全面准确地反映其耐铝性，需综合多种营养元素去评价作物的耐铝性才较为可靠。本研究以12种无机营养元素的耐铝系数作为判断葡萄单项耐铝性强弱的指标，并将这12种无机营养元素指标通过主成分分析法转换成既能够多方面地反映原指标的信息，又能将原指标中差异不明显的信息集中表现出来的5个全新的综合指标[26]。这5个综合指标共同决定26份葡萄种质资源的耐铝性，而并不仅仅由某一综合指标来完全决定。根据这5个综合指标值的贡献率求出其相应的隶属函数值，并进行加权，得到不同种质资源的耐铝性综合评价值，从而使各种质资源之间的耐铝性差异具有可比性。用聚类分析的方法将26份葡萄种质资源划分为3类：耐铝性较强的是小叶葡萄、红地球、黑玫瑰、黑提、SO4、黑加仑和左优红，耐铝性较弱的是通化-3、京秀、巨峰、北醇、玛丽欧、高山-2、毛葡萄、贝达、巨葡萄，其余为耐铝性中等。

3.2 葡萄耐铝性鉴定指标

在耐铝种质资源鉴定及耐铝新品种选育中，筛选出能够简单、快捷、可靠的鉴定指标尤为重要。目前，国内外学者已提出许多与作物耐铝性相关的形态及生理指标[27-32]，在葡萄上，也开展了一些耐铝性方面的研究，发现铝胁迫使葡萄叶绿素和类胡萝卜素含量下降，脯氨酸和铝含量上升，过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)活性上升等[4];此外,铝胁迫也会降低各无机营养元素的含量[33]，可作为葡萄耐铝性的鉴定指标。本研究从无机营养元素的角度来筛选葡萄种质资源的耐铝性鉴定指标，分析这些无机营养元素含量与耐铝性之间的关系，建立起葡萄耐铝毒鉴定的数学模型。最后通过最优回归方程使各种质资源的耐铝性得以量化，并且筛选出了叶片中K、Mg、Zn、B含量对耐铝性有显著的影响，使葡萄的耐铝性评价及耐铝种质资源的鉴定变得准确、快捷和高效。以后对新引入或新选育的葡萄种质资源，可通过测定这4种无机营养元素的含量后计算出D值，根据D值的大小来大致推测该种质资源的耐铝水平。